生物信息学 第6章 表达序列标签
生物信息学第六章序列模式识别1
生物信息学第六章序列模式识别（1）生物信息学：预测❒生物信息学最核心的问题：预测❒生物信息学工具的作用：预测❒生物信息学所有的分析：预测❒基本假设（贝叶斯的哲学理念）：我们能够通过对已知世界的观察，总结经验，并以此来预测未知世界已经存在或者即将发生的事物/事件❒在生物信息学中的应用：对现有的数据，使用合适的算法，进行训练，构建计算模型和计算工具，预测未知的现象序列模式❒功能结构域，functional domain ❒模体，motif❒模块，BLOCK❒模式，pattern/profile功能结构域/Domain❒具有完整的、独立的三级结构❒具有特定的生物学功能❒一般长度，几十到几百个氨基酸❒允许插入/缺失，即允许存在gap模体/Motif❒不具有独立的三级结构❒具有特定的生物学功能：结合，修饰，细胞亚定位，维持结构，等❒长度一般几个到几十个氨基酸或者碱基；❒例如，SUMO化的序列模体：Ψ-K-X-E (Ψ:A, I, L, V, M, F, P; X: 任意氨基酸)模块/BLOCK❒几个到几十个氨基酸❒无gap，从全局多序列比对的结果直接处理得到❒描述蛋白质家族或者一类蛋白质的序列保守性BLOCK模式/Pattern/Profile❒在算法上用来描述一类功能结构域，模体或者模块的表示方式❒根据序列数据，构建的预测模型❒数据形式：概率表示❒用来预测新的可能符合特定模式的序列❒例如，直接将Ψ-K-X-E视为SUMO化位点的，普适的“模式”，则可以预测所有包含该模式的蛋白质序列本章内容提要❒预测性能检验和评估❒位点特异性打分矩阵/权重矩阵模型 Position Specific Scoring Matrix (PSSM),Weight Matrix Model (WMM)❒模体发现：Gibbs Sampler等❒马尔科夫及隐马尔科夫模型❒翻译后修饰位点预测❒模式识别的其他算法简介预测性能的计算和检验❒样本/检验数据：阳性数据(P)，阴性数据(N) 阳性数据(P)：真实的，被实验所证实的数据阴性数据(N)：被实验所证明为无功能的数据❒对于预测结果的评测，定义：真阳性(TP): 阳性数据中被预测为阳性的数据假阳性(FP): 阴性数据中被预测为阳性的数据真阴性(TN): 阴性数据中被预测为阴性的数据假阴性(FN): 阳性数据中被预测为阴性的数据常用的检验指标❒灵敏度(Sensitivity, Sn): 对于真实的数据，能够预测成“真”的比例是多少-(Type II error)❒特异性(Specificity, Sp): 对于阴性的数据，能够预测成“假”的比例是多少-(Type I error)❒准确性(Accuracy, Ac): 对于整个数据集(包括阳性和阴性数据)，预测总共的准确比例是多少❒马修相关系数(Mathew correlation coefficient, MCC): 当阳性数据的数量与阴性数据的数量差别较大时，能够更为公平的反映预测能力，值域[-1,1]常用的检验指标ROC curve❒X轴：1-Sp❒Y轴：Sn❒ROC的面积越大，表明其预测能力越强预测性能的计算❒自适应法/自检法（Self-consistency validation） 训练数据当成测试数据训练数据中所有的阳性数据为测试数据中的阳性数据训练数据中所有的阴性数据为测试数据中的阴性数据❒反映当前预测工具对目前已知的数据的预测能力❒假设：根据目前已知的数据所构建的计算模型能够反映未知的数据的模式❒缺点：不能反映计算模型的稳定性❒除一法/留一法（Leave-one-out validation） 每次从数据集中去掉一个，包括阳性数据和阴性数据 利用剩下的数据重新训练，并构建新的计算模型对去掉的这一个数据进行打分保证每个数据去掉一次，从而得到所有数据的分值计算各个阈值的Ac, Sn, Sp和MCC❒N折交叉法（n-fold cross-validation） 将数据集分成n组，并保证阳性数据与阴性数据的比例与原数据相同随意将n-1组作为训练数据，重新训练并构建计算模型对剩下的1组进行打分，计算性能重复若干次(一般20次或以上足够)计算平均值❒自适应法/自检法: 反映预测性能❒除一法/留一法& N折交叉法: 反映预测系统的稳定性❒预测性能vs. 检验性能差距较小：系统稳定差距过大：系统不稳定，数据过训练阈值的确定❒Threshold 或Cut-off：人为设定，主要依据经验给定阈值以上或以下预测为阳性即利用阈值进行“一刀切”❒确定阈值的一般方法传统策略：平衡Sn和Sp，使两者大致相当实际应用：高Sp低Sn保证预测结果的可靠性 MCC最大值，保证综合预测性能最高…过训练（Overfitting/Overtraining）❒根据已知数据构建的模型只能很好的适用于训练数据❒不适合用来预测❒对训练数据的微小改变对于预测性能影响过大❒预测工具过训练：只能很好的符合训练数据，而对新数据则性能很差如何评估算法的准确性？❒例：某预测工具X使用400个阳性数据和1600个阴性数据训练计算模型。
EST（表达序列标签）测序服务
EST（表达序列标签）测序服务表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从动植物不同组织来源的cDNA序列，⼴泛应⽤于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域。
⽽随着⼈类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等⽅⾯都积累了⼤量的数据，如何充分利⽤这些已有的数据资源，加速⼈类基因克隆研究，同时避免重复⼯作，节省开⽀，已成为⼀个急迫⽽富有挑战性的课题摆在我们⾯前，采⽤⽣物信息学⽅法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃⾄全长cDNA，将为基因克隆和表达分析提供空前的动⼒，并为⽣物信息学功能的充分发挥提供⼴阔的空间。
★服务内容：我们提供构建完成的cDNA⽂库中EST序列测序，测序结果从峰图到序列的转化，低质量序列和载体序列去除，EST序列聚类、拼接，EST注释，ORF预测等。
★您需要提供的信息：新鲜菌液：体积⼤于500 uL的新鲜菌液，请保证该菌液由单⼀克隆获得。
质粒：浓度⼤于50 ng/µL，体积⼤于20 µL的质粒样本。
★服务价格：服务项⽬服务价格EST测序<5000条25元5000-10000条22元>10000条20元基础信息服务免费⾼级信息服务询价★服务周期：服务项⽬服务周期EST测序<5000条10个⼯作⽇5000-10000条15个⼯作⽇>10000条协商基础信息服务5个⼯作⽇⾼级信息服务协商★服务承诺：我们将提供给您测序峰图，去除载体的EST序列，EST拼接序列，基础数据分析结果。
如果您需要对数据进⾏更为详细的EST注释及ORF预测与分析，我们将另外收取⼀定的数据分析费⽤。
我们抽取所有样本的10%进⾏预实验以确定测序上样量，如果客户样品扩增效率不⼀致导致某些样品未检出信号，我公司仍收取检测费⽤。
为了保证实验进度，本公司采⽤批量上样的⽅法，如果预检测未发现异常，⽽实际检测后发现异常（如⼤量样本未扩出或扩增效率低等情况），我们会及时通知客户，由客户决定是否继续检测，之前产⽣的检测费⽤由客户承担。
医学专业 生物信息学第6章
重叠部分(over-lapping) 的ESTs整合至单一的簇(cluster) 中 聚类作用： ● 产生较长的一致性序列(contigs) ，用于注释 ● 降低数据的冗余，纠正错误数据。 ● 可以用于检测选择性剪切。 ESTs聚类的数据库主要有三个： ● UniGene (/UniGene) ● TIGR Gene Indices (/tdb/tgi/ ) ● STACK (http://www.sanbi.ac.za/Dbases.html )
● 对所发现的SNPs进行实验验证。
(五) ESTs与基因表达谱的构建
反转录
原位 合成
…. ….
Clone
反转录（可选）
连接， 转化
标记 杂交 读取光密度
…………. …………. ………….
利用EST，SAGE分析结果制 作芯片（研究已发现的基 因）
Gene Chip
• Rice genomewide DNA chip (60,000+预测基 因) • 果蝇基因芯片 …
(二) ESTs与基因识别
在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs) 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs) 已知基因的不同剪切模式的搜寻
(三) ESTs与基因预测
由于EST状态下的一个基因 的部分序列。使用合适的比对参数，大于90％的已经注 释的基因都能在EST库中检测到。
不能用于表达谱研究 cDNA逆转录引物
Oligo T引物 随机引物
EST技术流程
体内：翻 译
体外研究：反转 录
连接， 转化
转化效率问题（基因AGE） 测序成本已经大大降低
二、EST数据库
1993年前：EST收录于GenBank， EBI和DDBJ 1993年 NCBI 建立dbEST
表达序列标签在寄生虫功能基因组学研究中的应用
・综述・表达序列标签在寄生虫功能基因组学研究中的应用田小军,薛燕萍3(首都医科大学附属北京友谊医院,北京热带医学研究所,北京100050)【摘要】 随着后基因组时代的到来,基因组学已从结构基因组学向功能基因组学领域拓展。
表达序列标签(expressed sequence tags,EST)是一种快捷、高效地揭示基因组功能信息的方法。
本文就EST在寄生虫功能基因组学研究中的应用作一综述。
【关键词】 表达序列标签(EST);基因组学;寄生虫学;综述【中图分类号】 R38 【文献标识码】 A 【文章编号】 167325234(2008)0320231203[J ournal of Pathogen B iology.2008Mar;3(3):231-233.]Application of expressed sequence tag in the study of functional genomics of parasitologyTIAN Xiao2jun,XU E Yan2ping (B ei j ing Friendshi p Hos pital,Capital Medical Universit y,B ei j ing T ropical Medicine Research I nstitute,B ei j ing100050,China)【Abstract】 With post2genomic era coming,genomics has been expanded f rom structural genomics to functional genom2ics.Expressed sequence tag(EST)is a rapid and efficient approach to discover the f unctional information of genome.The application of EST in the study of f unctional genomics of parasitology was reviewed in this paper.【K ey w ords】 Expressed sequence tag(EST);genomics;parasitology;review随着后基因组时代的到来,基因组学已从结构基因组学向功能基因组学领域拓展,表达序列标签(expressed sequence tags,EST)技术应运而生。
表达序列标签EST概要
表达序列标签EST概要摘要：随着EST研究的开展、深入，以及相关研究技术和分析手段的不断改进并走向成熟，EST 数据资源不断丰富，而其本身又具备独特的优势和多方面的利用价值。
本文介绍了EST序列的获取、加工、储存、分配、分析和释读的相关研究。
关键词：EST 表达序列标签聚类cDNA文库生物信息学从事对生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和释读，并综合运用数学、计算机科学和生物学工具，以达到理解数据中的生物学含义的目的。
随着人类基因组计划在世界范围内的开展，生物信息学作为一门热门交叉学科，不断地完善和发展起来作为一种强有力的工具，它在帮助我们对巨量的生物信息进行归纳和理解，从而揭示生命的奥妙的过程中发挥了重要的作用。
然而信息的爆炸增长，面对复杂和庞大的数据库，如何有效地地获取我们所需要的信息，充分利用这些已有的数据资源，加速基因克隆研究已成为一个富有挑战性的课题。
表达序列标签的广泛应用，为大规模进行基因克隆和表达分析提供了强大的动力，也为生物信息学功能的充分发挥提供了广阔的空问表达序列标签(EST，Expressed Sequence Tag)是指从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表了一个完整基因的一小部分。
Adams等人在1991年提出了EST技术，宣布了cDNA大规模测序时代的开始。
随着大规模的测序，EST数据呈指数级增长。
到了1995年中，GenBank里ESTs的数量已超过非ESTs的数量；2000年6月，将近460万的ESTs 已占了GenBank里所有序列的62%。
ESTs序列不止来源于人类，NCBI的dbEST （EST database）中已包含了超过250种生物来源的ESTs，包括小鼠、大鼠、秀丽线虫和黄果蝇等。
除此之外，也有许多商业性的机构保存了一些属于机构内部不公开的ESTs 序列。
EST序列的制备EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
表达序列标签EST分析及其在林木研究中的应用
林业科学研究 2004,17(6):804～809Forest Research 文章编号:100121498(2004)0620804206表达序列标签(EST)分析及其在林木研究中的应用李 虹1,2,卢孟柱2,蒋湘宁1(11北京林业大学,北京 100083;21中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091)摘要:简要叙述了表达序列标签EST技术的原理和流程,综述了EST在研究林木木材形成和其它生物学过程时新基因的发现、基因表达分析和基因芯片方面的应用进展以及在开发林木单核苷酸多态性和简单序列重复等分子标记和构建遗传图谱方面的应用进展,并对其在林木基因组研究中的应用前景进行了展望。
关键词:EST;新基因发现;基因表达;分子标记中图分类号:Q78 文献标识码:A1991年Adams等人从三种人脑组织的cDNA文库中随机挑取609个克隆进行测序,从而得到一组人脑组织的表达序列标签EST(ex pressed sequence tags),并将其与数据库进行序列同源性对比,结果表明:该组EST中有36个代表已知基因,337个代表未知基因,这是关于EST技术应用的首次报道,并首次提出了EST的概念[1]。
随着人类基因组计划的顺利进行,EST技术首先被广泛应用于寻找人类新基因,绘制人类基因组图谱,识别基因组序列编码区等研究领域,之后又被广泛应用于植物基因组研究[2]。
随着EST测序的飞速发展,到2003年6月,美国国家生物技术信息中心(NC BI)的EST数据库中(dbEST)(http:ΠΠw w w.ncbi.nlm.nih.g ovΠdbESTΠindex.html)已录入的来自不同物种的不同组织的EST共有17291123条,其中人和鼠的最多。
EST也被广泛应用于新基因的发现、基因鉴定、基因克隆、构建基因组图谱、基因定位分析、基因表达分析等方面。
在植物方面,除了拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)、水稻(Oryza sativa L.)、小麦(T riticum aesti2 vum L1)、大麦(Hordeum vulgare L.)、大豆(G lycine max(L.)Merr.)、玉米(Zea mays L.)、棉花(G os2 sypium herbaceum L1)等模式植物和农作物以外,近年来也开展了一些木本植物的EST研究,首先报道的是火炬松(Pinus taeda L.)EST分析,随后是杂交杨(Populus tremula L.×P.tremuloides M ichx.)和毛果杨(P.trichocarpa‘T rich obel.’)等其它林木。
生物信息学期末考试答案
生物信息学期末考试答案Bioinformatics：生物信息学——是一门综合运用生物学、数学、物理学、信息科学以及计算机科学等诸多学科的理论方法；以互联网为媒介、数据库为载体、利用数学和计算机科学对生物学数据进行储存、检索和处理分析；并进一步挖掘和解读生物学数据。
Consensus sequence：共有序列——决定启动序列的转录活性大小。
各种原核启动序列特定区域内（通常在转录起始点上游-10及-35区域）存在共有序列；是在两个或多个同源序列的每一个位置上多数出现的核苷酸或氨基酸组成的序列。
Data mining：数据挖掘——数据挖掘一般是指从大量的数据中自动搜索隐藏于其中的有着特殊关系性的信息的过程。
数据挖掘通常是利用计算方法分析生物数据；即根据核酸序列预测蛋白质序列、结构、功能的算法等；实现对现有数据库中的数据进行发掘。
EST：(Expressed Sequence Tag)表达序列标签——是某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段；长度大约为200~600bp。
Similarity：相似性——是直接的连续的数量关系；是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。
Homology：同源性——是两个对象间的肯定或者否定的关系。
如两个基因在进化上是否曾具有共同祖先。
从足够的相似性能够判定二者之间的同源性。
Alignment：比对——从核酸以及氨基酸的层次去分析序列的相同点和不同点；以期能够推测它们的结构、功能以及进化上的联系。
或是指为确定两个或多个序列之间的相似性以至于同源性；而将它们按照一定的规律排列。
BLOSUM：模块替换矩阵——是指在对蛋白质数据库搜索时；采用不同的相似性分数矩阵进行检索的相似性矩阵。
以序列片段为基础；从蛋白质模块数据库BLOCKS中找出一组替换矩阵；用于解决序列的远距离相关。
在构建矩阵过程中；通过设置最小相同残基数百分比将序列片段整合在一起；以避免由于同一个残基对被重复计数而引入的任何潜在的偏差。
表达序列标签及其应用
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确定最佳均一化条件 用接头限制酶消化均一化的 !"#$
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克隆入载01用此方法$ 的 克 隆 数 从 原 和 低 丰 度 克 隆 &am.+ 的 数 量 相 差 44 倍 ， 量几乎相等， 可见均一化的处理是非常有效的。 结果 可 以 使 !"#$ 的 方法二： !"#$ 与基因组 "#$ 杂交法， 丰度都与基因组中与之互补的基因的丰度相一致。原始的
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述
表达序列标签及其应用
" 陈红歌 !， # 贾新成 !
（ 郑州 #$%%%& ； &"南京农业大学 资源与环境学院， 南京 &!%%’$ ） !"河南农业大学 生物工程学院， 在基因组作图、 克隆基因、 新基因的识别、 蛋白质组研究等许多方面具有重要的用途。本文 摘要 ‘ 表达序列标签（ "%#） 介绍了 "%#各方面的应用。 关键词 ‘ 表达序列标签 d 均一化 CF’G d 中图分类号 !!(B2
经扩增的 !"#$
! 热变性（ 6&&L ， % >.+ ） ! 退火（ G%L ， 70 、 0E 、 M7 、 NG O 等） !
羟基磷灰石柱层析
757
利用 !"# 数据库进行电脑克隆 为查询 在 <F?@A 中找到与待克隆基因相关的 ?@A， 寻 找 ?@A 重 叠 群 ， 对重 项通过 C9$@A# 软件对 <F?@A 进行搜寻， 叠群的共有序列进行比较，进而通过计算机程序整合成更长 最终有可能找到其相应的全长转录本， 得到目的 的 ?@A 序列，
质组进行一步鉴定， 这是很难实现的。 研究时是分开来就一个 个亚细胞蛋白质组进行的， 如膜蛋白质组、 各种细胞器蛋白质 组、 细胞核蛋白质组等等。 我们国家提出重点研究与人类疾病 密切相关的蛋白质， 也就是疾病蛋白质组研究。 先用二维凝胶 分离出正常细胞和疾病状态细胞的 蛋 白 质 ， 一般 电泳（ 73"? ） 用计算机对比正常和疾病状态细胞 可分出 7 &&&J4 &&& 个点， 的蛋白谱的差异， 可以找出新增或减少的蛋白质点， 然后将新 增或减少的蛋白质点转印至膜上，用特异蛋白酶水解后用 基 质 辅 助 激 光 解 析 离 子 化3飞 行 时 间3质 谱 K$9"D3AHI3K@ （
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（三）序列注释和分析
➢ 序列注释 ➢ 后续分析
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三、EST的用途
基因识别 基因表达谱的构建 发现新基因 SNP（single nucleotide polymorphism）发 现
电子PCR克隆
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(一) ESTs与基因识别
➢在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs) ➢在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs) ➢已知基因的不同剪切模式的搜寻
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(四) ESห้องสมุดไป่ตู้s与SNP位点预测
➢来自不同个体的冗余的ESTs可用于发现基因组中转录区 域存在的SNPs。 ➢应注意区别真正的SNPs和由于测序错误而引起的本身不 存在的SNPs。解决这一问题可以通过：
● 提高ESTs分析的准确性。 ● 对所发现的SNPs进行实验验证。
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（五）电子PCR克隆
➢ 去除其中的嵌合克隆
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EST数据预处理流程
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（二）ESTs的聚类
➢ 聚类目的：将来自同一个基因或同一个转录本的具有 重叠部分(over-lapping) 的ESTs整合至单一的簇 (cluster)中
➢ 聚类作用： ● 产生较长的一致性序列(contigs) ，用于注释 ● 降低数据的冗余，纠正错误数据。 ● 可以用于检测选择性剪切。
第6章 表达序列标签
Expressed Sequence Tags (EST)
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一、表达序列与表达序列标签
什么是表达序列? 基因组表达为mRNA的序列
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中心法则
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克隆区域
5‘测
3’测
序
序
位
位
置
置
EST的获得技术路线
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一、表达序列标签
表达序列标签
（expressed sequence tag, EST）
➢使用合适的比对参数，大于90％的已经注释的基因都能
在EST库中检测到。
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(二) ESTs与基因表达谱的构建
➢表达量比较分析：不同组织或发育阶段基因表达量比较 ➢EST来源于不同的组织，那么就可以对不同来源的基因 表达进行比较
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(三) ESTs与新基因预测
➢由于EST的一个基因的 部分序列。
从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从 5′末端或3′末端对插入的cDNA片段进行一轮单 向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序 列。
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二、EST数据分析方法
随机挑取克隆进行5′或3′端测序 序列前处理 聚类和拼接
基因注释及功能分类 后续分析
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（一）序列前处理
➢ 去除低质量的序列（如使用Phred）
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（一）dbEST（database of EST）
描述： ➢ Genbank的一部分 ➢ 63,236,621条数据（20091016） 向dbEST提交数据 ➢ 按格式编辑数据 ➢ 通过E-mail提交 ➢ 更新数据
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（二）UniGene数据库 简介 ➢ Genbank的一部分 ➢ 一条纪录为一个gene cluster
➢ 应用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch屏蔽数据组 中不属于表达的基因的赝象序列(artifactual sequences) ● 载体序列 (ftp:///repository/vector) ●重复序列(RepBase，) ● 污染序列 (如核糖体RNA、细菌或其他物种的 基因组DNA等)
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五、常用的EST数据库
数据库名称
网址
说明
dbEST
/dbEST/ 综合
UniGene /unigene 综合
Gene Indices /tgi/ 综合
电子PCR克隆，指利用已经有的片段进行 全长基因序列的分析。
5
3
5
3
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四、EST数据的不足
➢ESTs很短，没有给出完整的表达序列； ➢低丰度表达基因不易获得; ➢由于只是一轮测序结果，出错率达2%～5%； ➢有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或是基 因组DNA的污染； ➢有时出现镶嵌克隆； ➢序列的冗余，导致所需要处理的数据量很大。
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（三）Gene Indices数据库 简介 ➢ The Institute of Genomic Research Database 中的一个子库 ➢ /tgi/ 数据构成 ➢ 42类动物 ➢ 47类植物 ➢ 15类原生生物 ➢ 10类真菌