《外源基因的表达》PPT课件
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第七章-外源基因的表达PPT课件
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上， 才能够 构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效 率、高水平地表达。对于原核细. 胞来讲，基因表达的调控序 4
■-10区（Pribnow框，TATAAT）：RN
5
原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启 动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右 向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。
（2）终止子
在一个基因或一个操纵子的3’端往往有一个特定的核苷酸序 列 ， 它 有 终 止 转 录 的 功 能 ， 这 一 段 DNA 序 列 称 为 终 止 子 （terminator)。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一 段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C区域具有回文 对称结构，使转录后的RNA具有茎环结构。
这个载体系统是由pBR322为基础构建的。 ➢带有大肠杆菌最强的启动子之一，即Ipp（脂蛋白基因）启 动子。在启动子的下游装有lac UV5的启动子及其操纵基因， 并把lac阻遏子的基因（lac I）也克隆到这个质粒上。这样目 的基因的表达就成为可调节的了。 ➢在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（SD序列及ATG）。 ➢信号肽序列取自于大肠杆菌中. 分泌蛋白的基因ompa（外膜9 蛋白基因）。
根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于ρ因子 的转录终止子及不依赖于ρ因子的转录终止子。
《外源基因的表达》PPT课件
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
精选ppt
3
原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：
（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制， 可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。
（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于 构建相应的表达载体。
一、启动子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
精选ppt
5
1. 原核生物的启动子
原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录 起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。
识别区 Pribnow框 转录起点
16～19bp
5～9bp
5’ TTGACA TATAAT A（G） 3’
RNA … NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH
精选ppt
14
N
N
N
N
C
GC
CG C G RNA结构
GC
CG
GC
AU
AU
……NNNN UUUU-OH3
图： 强终止子模式图
精选ppt
15
三、SD序列:
mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列 四个特征要素：
精选ppt
7
（3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体 保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称 为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱 基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。
（4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与 Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在 长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守 性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重 要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要 因素。
精选ppt
3
原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：
（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制， 可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。
（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于 构建相应的表达载体。
一、启动子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
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5
1. 原核生物的启动子
原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录 起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。
识别区 Pribnow框 转录起点
16～19bp
5～9bp
5’ TTGACA TATAAT A（G） 3’
RNA … NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH
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14
N
N
N
N
C
GC
CG C G RNA结构
GC
CG
GC
AU
AU
……NNNN UUUU-OH3
图： 强终止子模式图
精选ppt
15
三、SD序列:
mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列 四个特征要素：
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7
（3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体 保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称 为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱 基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。
（4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与 Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在 长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守 性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重 要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要 因素。
外源基因表达ppt课件
序列修饰，pr稳定性因子 优化发酵过程：工艺 生物学：菌体生长，表达条
件，产物总量
The expression vector
Most important elements in the vector
Promoter
-35: TTGACA (E. coli ) -10: TATAAT (E. coli )
Terminator (hairpin) Ribosome binding site (RBS) Selection marker Vector replication sequence
(ori) Polylinker (MCS)
In the gene/vector
tac promoter
GAL system
Gene cloned under control of the GAL4 promoter Induction by galactose as the sole carbon source Stronger induction by PGAL1 Gal4p transcriptional activator - 1-5% of total protein - Leaky promoter
赵 子 昂
第七章 基因表达系统
外源基因表达系统 泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适受体细
胞，并在其中有效表达，产生目的基因产物 1．E. coli表达系统： 常用lac & tac：以lac操纵子调控机制为基础：lacP
lacO 结构基因（lacZ, Y, A），lacI 阻遏pr，IPTG诱 导， PL & PR：以phage溶原/溶菌循环 T7启动子：T7RNA聚合酶识别序列在pET中MCS上 端，RNA聚合酶位于BL21(DE3)基因组中，上端为 lac启动子调控，IPTG
件，产物总量
The expression vector
Most important elements in the vector
Promoter
-35: TTGACA (E. coli ) -10: TATAAT (E. coli )
Terminator (hairpin) Ribosome binding site (RBS) Selection marker Vector replication sequence
(ori) Polylinker (MCS)
In the gene/vector
tac promoter
GAL system
Gene cloned under control of the GAL4 promoter Induction by galactose as the sole carbon source Stronger induction by PGAL1 Gal4p transcriptional activator - 1-5% of total protein - Leaky promoter
赵 子 昂
第七章 基因表达系统
外源基因表达系统 泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适受体细
胞，并在其中有效表达，产生目的基因产物 1．E. coli表达系统： 常用lac & tac：以lac操纵子调控机制为基础：lacP
lacO 结构基因（lacZ, Y, A），lacI 阻遏pr，IPTG诱 导， PL & PR：以phage溶原/溶菌循环 T7启动子：T7RNA聚合酶识别序列在pET中MCS上 端，RNA聚合酶位于BL21(DE3)基因组中，上端为 lac启动子调控，IPTG
外源基因在酵母菌中表达讲义课件
达稳定期关闭
• UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
• UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•8
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
• UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•12
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRpp质粒的构建 • ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体
上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型
质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆 位点的大肠杆菌质粒DNA。
以ARS为复制子的质粒称为YRp
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•27
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统 • 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性
较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油 激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，
多种重组外源蛋白获得成功表达。 • 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，
基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） • 酵母菌是最简单的真核模式生物
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•2
酵母菌的宿主系统
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与
巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分
• UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
• UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•8
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
• UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•12
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRpp质粒的构建 • ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体
上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型
质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆 位点的大肠杆菌质粒DNA。
以ARS为复制子的质粒称为YRp
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•27
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统 • 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性
较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油 激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，
多种重组外源蛋白获得成功表达。 • 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，
基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） • 酵母菌是最简单的真核模式生物
•外源基因在酵母菌中表达讲义
•2
酵母菌的宿主系统
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与
巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分
基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1)
复性与重折叠 ：
● 主要任务： 通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 复 性：
分段稀释法 一步稀释法 试剂添加法 蛋白修饰法 产物隔离法 分子伴侣法
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 二硫键形成
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
劣势
缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白 胞内含多种内毒素
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
◆ 启动子
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
包涵体的溶解与变性 ： ● 主要任务：拆开错配的二硫键和次级键
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
溶解与变性 ：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸
● 试剂和条件：
促溶剂 盐酸胍、尿素 混合溶剂
极端pH
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 密码子
密码子偏爱性： 密码子偏爱性对外源基因表达的影响：
策略
外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达
化学氧化法 二硫键交换法
● 主要任务： 通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 复 性：
分段稀释法 一步稀释法 试剂添加法 蛋白修饰法 产物隔离法 分子伴侣法
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 二硫键形成
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
劣势
缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白 胞内含多种内毒素
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
◆ 启动子
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
包涵体的溶解与变性 ： ● 主要任务：拆开错配的二硫键和次级键
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
溶解与变性 ：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸
● 试剂和条件：
促溶剂 盐酸胍、尿素 混合溶剂
极端pH
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 密码子
密码子偏爱性： 密码子偏爱性对外源基因表达的影响：
策略
外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达
化学氧化法 二硫键交换法
外源基因表达与基因工程药物ppt课件
➢ 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等
➢ 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
➢ 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
• 粘性质粒(cosmid)
粘性质粒
也称柯斯载体。是带有粘性末端位 点的质粒, 柯斯质粒是人工建造的的含有 λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊 类型的质粒载体。
粘性质粒
用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体 的cos末端及质粒重组而成的载体。cosmid载体带 有质的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬 菌体用于包装的cos末端等。
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
➢ 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
➢ 作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
➢ 命名：
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
外源基因的表达2精品PPT课件
❖T A A T G T ❖T T A A C T ❖T A T A A T ❖T A T A A T
a) 大肠杆菌的lac启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
基底水平转录 阻遏蛋白
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
P
存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅
RNA聚合酶保护区 结构基因
5
3
3
5
5
3
-50 -40 -30 -20 -10 1 10
3
5-35 区Biblioteka TTGACA AACTGT
RNA-pol辨认位点 (recognition site)
开始转录 -10 区
T A T A A T Pu A T A T T A Py
(Pribnow box)
原核生物启动子保守序列
❖ T7噬菌体启动子
② 终止子
❖ 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过 头现象，即RNA聚合酶继续转录质粒上邻近的DNA 序列；
❖ 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工 程菌无谓的能量消耗；
❖ 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终 止信号的DNA序列。
❖ 两类终止子 使用不依赖ρ因子的终止子
❖ 启动子
❖ -35 区序列
❖ -10 区序列
❖ PlL
❖T T G A C A
❖ PtraA ❖ Ptrp ❖ Plac ❖ Ptac
❖T A G A C A ❖T T G A C A ❖T T T A C A ❖T T G A C A
❖ Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
a) 大肠杆菌的lac启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
基底水平转录 阻遏蛋白
野生型的Plac与其控制区Olac
偶联在一起，在没有诱导物
P
存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅
RNA聚合酶保护区 结构基因
5
3
3
5
5
3
-50 -40 -30 -20 -10 1 10
3
5-35 区Biblioteka TTGACA AACTGT
RNA-pol辨认位点 (recognition site)
开始转录 -10 区
T A T A A T Pu A T A T T A Py
(Pribnow box)
原核生物启动子保守序列
❖ T7噬菌体启动子
② 终止子
❖ 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过 头现象，即RNA聚合酶继续转录质粒上邻近的DNA 序列；
❖ 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工 程菌无谓的能量消耗；
❖ 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终 止信号的DNA序列。
❖ 两类终止子 使用不依赖ρ因子的终止子
❖ 启动子
❖ -35 区序列
❖ -10 区序列
❖ PlL
❖T T G A C A
❖ PtraA ❖ Ptrp ❖ Plac ❖ Ptac
❖T A G A C A ❖T T G A C A ❖T T T A C A ❖T T G A C A
❖ Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
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24
2.宿主菌 蛋白水解酶缺陷型 菌株如:BL21等
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25
3.常见大肠杆菌表达系统 ①Lac和Tac标达系统 以lac操纵子调控机 制为基础设计和构建 的表达系统
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26
阻遏蛋白过量表达
当带lac操纵区的基因多拷贝存在，lacI表达的阻遏蛋 白不够用时，采用阻遏蛋白过量表达突变体
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12
第二节 基因表达调控元件
1.启动子(promoter) ①序列特异性 ②方向性 顺式调控元件 ③位置特性 转录区上游 ④种属特异性
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13
(1)原核生物启动子
①转录起始位点 ②Pribnow框 ③Sextama框 ④间隔区
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14
(2)真核生物启动子
I型启动子 rRNA II型启动子 mRNA
外源基因的表达
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1
第一节 基因表达的机制
1.外源基因的转录 2.mRNA的延伸与稳定性 3.外源基因mRNA的有效翻译 4.表达蛋白在细胞中的稳定性 5.目的基因的沉默
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2
1.外源基因的转录
启动子类型： 组成型启动子
原核生物T7启动子 诱导型启动子
原核生物lac、trp等
组织特异性表达启动子
受体细胞存在的蛋白水解酶可降解外源蛋白 避免或降低被水解的途径: ①构建融合蛋白表达系统 ②构建分泌蛋白表达系统 ③构建包涵体表达系统 ④选择蛋白水解酶缺陷型受体系统
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11
5.目的基因沉默 基因沉默(gene silencing) 位置效应 转录水平(TGS) 甲基化 转录后(PTGS) siRNA
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3
2.mRNA的延伸与稳定性
原核生物避免序列存在衰减子(attenuator) 带有正常转录终止序列 受体细胞情况
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4
trp衰减子
A
B
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5
带有正常转录终止序列
真核生物要带有转录终止序列与poly(A) 渗入位点 poly(A)渗入信号序列AAUAAA
精选ppt
6
受体细胞情况
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22
一.大肠杆菌表达系统
1.大肠杆菌表达载体 (1)复制子 高拷贝 pMB1、p15A、ColE1等 低拷贝 pSC101等 (2)启动子与终止子
精选ppt
23
(3)核糖体结合位点(SD) AGGAGG 翻译起始密码子与SD的距离 SD后为AAAA或UUUU效率最高
(4)密码子 (5)选择标记
外源蛋白基因与受体菌蛋白基因重组，不改变两 个基因的阅读框，表达的蛋白为融合蛋白
A
B
Gene
A
B
N
C Protein
精选ppt
33
融合蛋白的优点：
在自身蛋白引导下，形成良好的杂合构象，可很 大程度封闭蛋白水解酶切割位点 某些情况下，具有水溶性和一定生物活性 易于分离纯化
分布位置
主要存在于细胞质中，也存在于细胞周质
构成
主要为表达的外源蛋白，还有RNA聚合酶、核糖
核蛋白体等，此外还包括一些DNA、RNA、脂
多糖等非蛋白成分
精选ppt
30
包涵体的形成
①折叠状态的蛋白聚集作用
高表达导致水难溶的折叠态蛋白分子间相互作 用而聚在一起
②非折叠态的蛋白聚集作用
在较高培养温度的细菌中，热稳定性差的蛋白 处于非折叠态，以二硫键等结合在一起
精选ppt
18
2.增强子(enhancer) ①双向性 ②重复序列 ③与所处位置无关 ④特异性 ⑤可增强异源基因
精选ppt
19
3.终止子(terminator) 常用大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2 噬菌体上TΦ
4.衰减子(attenuator) 5.绝缘子(insulator) 6.反义子(antisense RNA)
密码子偏爱性
主密码子(major codon)
罕用密码子(rare codon)
精选ppt
9
翻译终止 UAA UAG UGA
释放因子(release faF2 UAA UGA
真核 两种eRF UAA 终止效率最高
精选ppt
10
4.表达蛋白在细胞中的稳定性
TATA框 CAAT框 GC框 III型启动子 tRNA 5SrRNA sRNA
精选ppt
15
(3)启动子与转录的启动
原核σ亚基参与起始
真核生物转录启动较复杂
精选ppt
16
(4)启动子的分离
①随机克隆法
HindIII EcoRI
②聚合酶保护法
加入聚
A
合酶
B
精选ppt
AB
17
③过滤膜结合法 ④PCR方法
原核生物 最佳选择RNase缺失个体 真核生物 mRNA正确加工，提高稳定性
精选ppt
7
3.外源基因mRNA的有效翻译
原核生物
①AUG(ATG)首选起始密码子 ②SD序列 ③SD与起始翻译密码子间合适距离 ④翻译起始区周围不易形成明显的二级结构
精选ppt
8
真核生物
具有类似于SD序列的保守区CCA(G)CCATGG 对于翻译效率仍然十分重要
③蛋白折叠中间体的聚集作用
由于折叠中间体的难溶而聚在一起
精选ppt
31
包涵体表达的优缺点 包涵体表达的优点： 简化外源表达蛋白的分离 保持表达产物结构稳定
包涵体表达的缺点：
表达的外源蛋白丧失了原有生物活性，必须经过 有效的变性、复性操作，才能得到具有正确空间 构想的活性蛋白体
精选ppt
32
融合蛋白
28
4.外源基因在大肠杆菌表达的形式 外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能 存在于： 细胞质、细胞周质、细胞外培养基
表达蛋白形式 可溶性蛋白 不可溶性蛋白
精选ppt
29
包涵体 (inclusion body)表达蛋白
一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中 积累，并致密地聚集在一起，形成无膜的或被膜 的裸露结构
精选ppt
20
第三节 外源基因表达系统
原核表达系统 真核表达系统
精选ppt
21
目前广泛应用的为原核系统特点
大肠杆菌、芽胞杆菌、链霉菌等
①单细胞、生长快、易控制 ②基因组结构简单 ③含质粒或噬菌体 ④生理代谢途经与基因表达调控比较清楚 ⑤不具备真核生物蛋白加工系统 ⑥内源蛋白酶会降解外源蛋白，表达产物不稳定
lacI突变体lacIq
温度敏感型突变体lacIq(ts)
30°C抑制表达
42°C转录保持开放
精选ppt
27
②PL和PR表达系统 cI基因表达蛋白阻遏PL和PR表达 cI基因温度敏感型突变体cI857(ts)
③T7表达系统
T7噬菌体RNA聚合酶高效率转录
在大肠杆菌内，存在T7噬菌体RNA聚合酶
下，T7启动子可高效精转选ppt录