葡萄籽原花青素的梯度分离及其抗氧活性研究
原花青素的提取、分离及抗氧化性、稳定性的研究
原花青素的提取、分离及抗氧化性、稳定性的研究本文以葡萄籽、葡萄叶子为原料，对其原花青素的提取工艺进行了研究。
在提取葡萄籽中的原花青素时采用50％乙醇，料液比1／40，于60℃下热回流浸提2个小时，提取2～3次最优提取工艺，此工艺提取得到的原花青素提取物得率为22.01％，产品纯度为51.17％；提取葡萄叶子时采用70％乙醇，料液比1／50，于80℃下热回流浸提3个小时，提取1～2次的最优提取工艺，此工艺得到的原花青素得率为34.14％，纯度为13.66％。
对上述提取物进一步纯化，葡萄籽提取物选用AB-8大孔吸附树脂，50％乙醇为洗脱剂，流速控制在4mL／min左右，葡萄籽原花青素总的提取得率为9.09％，产品纯度能达到94～95％；葡萄叶子提取物选用D-101大孔吸附树脂，70％乙醇为洗脱剂，流速控制在4mL／min左右，其原花青素提取得率为18.21％，纯度为25.63％。
采用超滤法对大孔吸附后的葡萄籽精提物进行低聚体的提纯，其过膜后的单体儿茶素含量有明显增加，P5000约为过膜前的6.6倍，P1000为过膜前的7.7倍。
其中压力对超滤通量的影响较大，而温度影响较小，一般选择20～30psig，室温下操作即可，避免在操作过程中长时间将过滤液暴露于强光及空气中。
利用Sephadex LH20将P5000样继续分离，使含量较高的一种二聚体得到了富集。
原花青素的抗氧化(FRAP)、清除DPPH自由基实验表明，葡萄叶子原花青素抗氧化、清除自由基活性均强于抗坏血酸，稍强于葡萄叶子提取物，而与原花青素的低聚体、高聚体相差不大。
原花青素在不同温度、光照、氧气的条件下1～2天内具有较好的稳定性。
经长期(10天)紫外光照射不稳定，含量下降甚至消失，溶液颜色逐渐加深，但其抗氧化、清除自由基能力无显著性变化(p＞0.05)。
抗坏血酸对紫外照射引起的原花青素不稳定能起到保护作用，并且存在剂量依赖效应。
类似于口服液等的原花青素溶液产品较适用微波法灭菌。
葡萄籽提取物原花青素磷脂复合物抗氧化功能的实验研究
量、 超 氧 化 物 歧 化 酶 和 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 活 性 及 还 原 性 谷 胱甘 肽 含 量 的变 化 ， 观 察 葡 萄 籽 提 取 物 原 花 青 素 磷 脂 复 合 物 的 抗 氧 化 作 用 。结 果 原 花青 素磷 脂 复合 物 各 剂 量 组 的大 鼠体 重 与 模 型 组 及 空 白对 照 组 比 较 ， 均 无 统计 学 差 异 （ Ｐ＞０ ． ０ ５ ） 。原 花
葡萄 籽 提取 物原 花 青 素磷脂 复合 物抗 氧化 功 能 的实验 研 究
苗智如 ， 袁 夏 ， 廖 丽娜 ， 侯 中海 ， 蒋 国军 （ １ ． 杭州市萧山区第一人民医院药剂科， 浙江 杭州 ３ １ １ ２ ０ ０ ； ２ ． 浙江萧山医
院 药 剂科 ， 浙江 杭州 ３ １ １ ２ ０ １ ）
［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｔ ｈ ｅ ａ ｎ ｔ ｉ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｎ ｔ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ ｇ ｒ ａ ｐ ｅ ｓ ｅ ｅ ｄ ｐ ｒ ０ ａ ｎ ｔ ｈ ｏ 。 ｙ ａ ｎ ｉ ｄ ｉ ｎ ｓ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ｏ ｌ ｉ ｐ ｉ ｄ ｃ ｏ ｍ ｐ ｌ ｅ ｘ （ Ｇ Ｓ Ｐ Ｐ Ｃ ） ．Ｍｅ ｔ ｈ －
［ 摘要 ］ 目的
探 讨 葡 萄 籽 提 取 物 原 花青 素磷 脂 复 合 物 的抗 氧 化 作 用 。 方 法
取 大鼠 ８ Ｏ只 ， 随 机 分 为 ８组 ： 空 白对 照
葡萄籽低聚原花青素化学成分及抗氧化研究
（ ０ ８ ０ ０ １ ２０４２２ ）
研究表 明 ， 葡萄籽原花青素是迄今 为止所发 现的最有 效 的 自由基 清除剂之一 ， 特别是低 聚花青 素可 以清 除 体 内的 自由基和活性氧 ， 能预防因人体血 液 中低密度
葡 萄籽原花 青素 由不 同数 目的黄烷 醇一 茶素 、 儿
表儿茶 素聚合而成 ，通 常将 二一 四聚体称为低 聚原 花 青素 （ｒｃａｉｏ ｃ ｌ ｏ ｅ， Ｐ ， ｐｏｙｎｄｌ ｉ ｍ ｒＯ Ｃ）五聚体 以上 的称 为 ｉｏｇ 高聚体 （ｒｃａｉｏ ｃ ｏ ｍ ｒ，Ｐ ）对于葡萄籽原 花 ｐｏｙｎｄｌ ｌ ｅｓＰ Ｃ ， ｉｐ ｙ 青素抗 氧化性 的研究报 道很 多Ｉ ｌ ｌ， ＿ 既包括动物体 内抗 ５ 氧化试 验 ，又包括体外 细胞 培养及用化 学方法测定 。
和ｏｃ 对 Ｄ Ｐ 自由基 和羟 自由基都 具有较好的清除活性。对 Ｄ Ｐ 自由基的清除作 用与 ｖ 相 ３，其 Ｉ 分别为 ｐ Ｓ ＰＨ ＰＨ ＂ － ｃ １ ０ｔ ／ Ｌ和 １ ９ Ｉ ／ Ｌ ． ｇｍ ２ ｘ ． ￣ ｍ ，明显 强 于 Ｖ 和 Ｔｏ ｘ ３ ｇ ｃ ｒｏ ；原花青 素 Ｂ 和 ｏｃｓ ｌ ２ ｐ 对羟 自由基 的抑制 率明显 高于 Ｖ 、 Ｅ ｃＶ 和 Ｔｏｏ。ｐ 经过层析分离纯化后得 到的原花青素 Ｂ 清除 Ｄ Ｐ 自由基 的效果有所提 高，但 对于羟 自由基的清除活 ｒ ｘｏｃ ｌ ｓ ＰＨ
ａ ｄ ＲＰ ｎ —ＨＰ ＬＣ． ｅａ ｔｏ ｉａ ｔａ ｔ ｉ ｆｐ ｏ ｎ ｈ ｃ ａ ｉ ｉ ， ｅ ｖ ｒｔｏ ， ｎ ｘｒｃ ｓ ａ ｐｅ ｐ ｌｐ ｅ ｏ ， ， Ｔｈ ｎ ｉｘｄ ｎ ｃ ｉ ｔ ｏ ｒ ａ ｔｏ ｙ ｎ ｄｎ Ｂ２ｒ ｓ ｅ ａｒ ｌｗｉｅｅ ｔａ ｔ， ｐ ｌ ｏｙ ｈ ｎ ｌ Ｖｃ ｖｙ ＶＥａ ｄ Ｔｒｌｘ ｗｅ ｅ ｄ ｔｒ ｉｅ ｙｓ ａ ｅ ｇｎ ＰＨ ａ ｉａ ｎ ｙ ｒ ｘ ｌｒｄ ｃ １ Ｈｏ ｖ ｒ ｐ ｏ ｎ ｈ ｃ ａ ｉ ｉ ｎ ｏｏ ｒ ｅｅｍ ｎ ｄ ｂ ｃ ｖ ｎ ｉ ｇ ＤＰ ｒ ｄ ｃ ｌａ ｄ ｈ ｄ ｏ ｙ ａ ｉ ａ． ｗｅ ｅ ， ｒ ａ ｔ ｏ ｙ ｎ ｄ ｎ Ｂ ｎ ｏ ｃＳ ｈ ｗｅ ｍｏ ｅ ｆ ｃｉｅ ｔ ｃ ｖ ｎ ｉｇ ２ ａ ｄ ｐ ｓ ｏ ｄ ｒ ｅｆ ｔｖ ａ ｓ ａ ｅ ｇｎ ＤＰ ｅ ＰＨ ・ ｗｉｈ Ｃ５ ｖ ｌ ｅ ｏ １２ ａ ｄ ．９ ￣ｍｏ／ ｔ Ｉ ０ ａｕ ｓ ｆ ．０ ｎ １３ ｌＬ．
葡萄原花青素提取与纯化技术的研究及应用研究总结报告
（2）在相同的条件下，选择水、石油醚、乙醇三种不同溶剂对原花青素提取效果进行实验对比，取相同量的提取液定容，于500nm波长下测定吸光值，石油醚提取液的吸光值0.002，水提取液的吸光值0.413，乙醇提取液的吸光值0.523。
通过3种不同溶剂对原花青素提取效果影响的研究，选择了乙醇作为提取原花青素的溶剂。
自2022年11月成立以来，建立了天然植物活性成分多功能提取纯化研究、加工生产基地，对枸杞多糖、葡萄原花青素、番茄红素产品进行了开发，其中番茄红素获国家发明专利，并获得自治区科技进步二等奖；枸杞多糖通过了自治区科技成果鉴定，番茄红素粉、葡萄原花青素产品通过了自治区新产品鉴定，技术达到国内先进水平。
公司现有一套工业化生产设备，具有年产2吨植物活性产品的生产能力，产品有天然番茄红素、枸杞多糖、葡萄原花青素和叶黄素产品，产品已进入国际市场。2022年，实现销售收入810万元，公司资产由创业初期的30万元，增加到了2205万元，新增就业30人。因2022年新疆“七.五”事件的影响，企业的国外市场受到毁灭性打击，效益严重下滑，经过公司努力，现已逐步改变了市场形势。
葡萄原花青素提取与纯化技术的研究及应用研究总结报告
Masquelier通过对葡萄籽的提取物中OPC的深入研究发现，OPC是当今医学界发现的最安全高效的纯天然抗氧化剂，其抗氧化能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍，它能有效清除体内多余的自由基，保护人体细胞组织免受自由基的氧化损伤，同时，还具有改善人体微血管的通透性，使严重静脉曲张病人的静脉增加弹性，提高皮肤抗氧化技能，加强和保护人体活性组织、稳定细胞膜以及抗酶活性（组胺脱羧酶）等生物特性。
葡萄籽原花青素的制备及活性研究
注： “＋”表示有显色反应呈阳性， “－ ”表示显色反应呈阴性。
２．３ 葡萄籽原花青素含量 在酸性条件下，原花青素环的化学活性较高，
其结构中的间苯二酚或间苯三酚可与香草醛缩合， 产物在浓盐酸作用下形成有色的正碳离子，采用吸 光度法测其吸光度，根据原花青素标准曲线（图 １）， 即可得到原花青素含量（表 ３）。原花青素在索氏提 取各组分中的含量进行比较：乙酸乙酯＞丙酮＞乙 醇＞乙醚＞二氯甲烷＞石油醚，原花青素主要存在于 乙酸乙酯、丙酮、乙醇和乙醚组分中。
Ｄｅ ｔｅ ｃｔｉｏｎ ＆ Ａｎａ ｌｙｓ ｉｓ
检测与分析
葡萄籽原花青素的制备及活性研究
荆晓艳，马庆一，王玲玲 （郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 ４５０００２）
摘要：选用多种有机溶剂，经过梯度分离，从葡萄籽中得到葡萄籽原花青素提取物，并采用邻苯三酚和 ＤＰＰＨ 方法研究 提取物的清除自由基活性。实验结果表明：通过显色反应，可初步判断各溶剂提取物中含有黄酮类和多酚类物质；利用 邻苯三酚和 ＤＰＰＨ 检测方法，证明各提取物具有清除超氧阴离子自由基和 １，１－ 二苯基－ ２－ 苦肼基的活性，其中乙酸乙 酯提取物清除自由基的效果最好。 关键词：葡萄籽；原花青素；邻苯三酚法；ＤＰＰＨ 法 中图分类号：Ｏ６５７．３１ 文献标识码：Ａ
超声提取葡萄籽原花青素工艺的优化及其抗氧化活性研究
（ Ａｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ａ ｎ ｄ Ｔｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｃｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｆ Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ Ｔｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ， Ｊ ｉ ｌ ｉ ｎ １ ３ ２ ０ ２ ２， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ） Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｒｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｓ ｅ ｓ ｕ ｒ ｆ ａ ｃ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ（ Ｒ Ｓ Ｍ）ｉ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｓ ｏ ｎ ｉ ｃ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ
ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｓ ｏ ｎ ｉ ｃ ｔ ｉ ｍｅ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｙ ｉ ｅ ｌ ｄ ｏ ｆ ｐ ｒ ｏ ｃ ｙ ａ ｎ ｉ ｄ ｉ ｎ ｓ ．Ｔｈ ｅ ｎ ａ ｒ ｅ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｍｏ ｄ ｅ ｌ ｉ ｓ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ．
籽原花 青素的提取率 为 ２ ． ４ ８ ２ ， 与回 归模型预测值 的相 对偏 差为 ０ ． ３ ６ ９ ， ６ 。 同时进行 了提取 物的抗氧化性
检验 ， 结 的清除能力 ， 且呈剂量相 关性 。
关键 词 ： 葡 萄籽 原花 青素 （ ＧＰ Ａ） ； 超 声提 取 ； 响应 曲面 ； 抗 氧化 中图分类 号 ： ＴＳ ２ ０ ２ ． ３ 文献 标志 码 ： Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０ － ９ ９ ７ ３ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ４ ． ０ ２ ６
葡萄籽中分离提取原花青素的研究
葡萄籽中分离提取原花青素的研究花青素是一类多酚类化合物，其具有高效的清除自由基的功能，是一种新型、高效、低毒的天然抗氧化剂。
本实验通过浸提的方法从葡萄籽中提取原花青素，考察了不同溶剂、浸提时间、浸提温度、乙醇体积分数和料液比等单因素对浸提效果的影响，确定了最佳的单因素水平。
研究结果表明：本项目产品投资费用少，操作费用低，产品附加值高；原料为废物利用，变废为宝符合国家相关产业政策；几乎没有“三废”排放，使用的溶剂全部回收利用，废渣可以作为造纸或者饲料综合利用。
标签：花青素；葡萄籽；提取；正交实验1 概述原花青素是广泛存在于植物中的一类天然多酚类化合物，多以糖苷的形式存在，也称花色苷。
属于缩合鞣质或黄烷醇类。
最早而最丰富的花青素是从红葡萄渣中提取的葡萄皮红。
它于1879年在意大利上市。
由于原花青素的多种功效，由葡萄籽提取的原花青素已被我国卫生部批准为保健原料。
目前对原花青素的提取研究及保健作用研究已非常成熟。
已经将其应用到工业化产业，开发出多种原花青素的保健产品和化妆产品。
原花青素的产品已被广大消费者普遍接受。
2 葡萄籽中花青素的提取本实验通过浸提的方法从葡萄籽中提取原花青素，考察了不同溶剂、浸提时间、浸提温度、乙醇体积分数和料液比等单因素对浸提效果的影响，确定了最佳的单因素水平。
并通过设计正交实验，得出原花青素提取最佳工艺条件。
2.1 实验方法2.1.1 葡萄籽中原花青素的提取本实验采用甘肃紫轩酒业葡萄酒厂生产葡萄酒产生的葡萄籽下脚料作为本实验的原材料。
在生产葡萄酒压榨葡萄汁的糟粕和葡萄酒生产前和发酵后压榨的榨粕，所得的这些榨渣中，以换成干品计，约有50%的葡萄皮，45%的葡萄籽和少量的梗等，将该榨渣经粗选分离出葡萄籽，作为提取的原料。
所得的葡萄籽用粉碎机粉碎后，过20目筛，于磨口三角瓶中，经石油醚脱脂脱水份，得脱脂葡萄籽粉，用一浸提液在50℃的恒温水浴中回流浸提，离心后取上清液，反复提取若干次，最后洗涤残渣，将上清液和洗涤液合并，加入固体无水硫酸钠脱水，倾出上层溶液，在真空度为0.095MPa，温度为40℃的条件下真空浓缩，浓缩液冷却至室温，得到原花青素粗提液，干燥，制得粗提物。
葡萄籽原花青素的分离纯化及其抗氧化活性研究
吸附量 ＝（初始浓度 － 平衡浓度）×溶液体积 树脂重量
解吸率＝ 洗脱液中原花青素总量 树脂吸附原花青素总量
× １００％
２．３．２ ＡＤＳ－８ 树脂的吸附流出曲线与解吸曲线的绘制 处理后的Ａ Ｄ Ｓ － ８ 树脂于水中湿法装柱，玻璃柱
Ｏ１ １ ． ９ ×４２ｃｍ，其中树脂装填高度３２ｃｍ ，床体积约 ９０ｍｌ。将葡萄籽原花青素粗提物用水稀释至原花青素 浓度分别为５．８、１５．０ｍｇ／ｍｌ，以２ｍｌ／ｍｉｎ流速上样分 步收集流出液（１０ｍｌ／管），测定其中原花青素浓度。 以流出液体积（ＢＶ ）为横坐标、流出液中原花青素浓 度Ｃ与进样原花青素浓度Ｃ０之比（Ｃ／Ｃ０）为纵坐标，绘 制吸附透过曲线。
青素提供参考。
１ 实验材料
１．１ 实验仪器 Ｗａｔｅｒｓ公司高压液相色谱仪，ＨＨＳ型电热恒温水浴
锅，ＳＨＺ－８２水浴恒温振荡器，ＵＶ－２１００紫外／可见分光 光度仪，Ｚ Ｆ Ｑ － ８ ５ Ａ旋转蒸发仪，Ｔ Ｄ ５ Ａ － Ｗ Ｓ台式低速离 心机。 １．２ 实验材料
ＡＢ－８、ＡＤＳ－８和Ｓ－８型大孔树脂，购于南开大学化 工厂；原花青素标准品（浓度≥９５％），购自天津尖峰 天然产物有限公司；葡萄籽是新疆葡萄酒厂下脚料；亚 油酸（不含抗氧化剂，含量≥９０％）由本实验室用红花 油提取；工业级乙醇、Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷）及所 用其他化学试剂均为分析纯。
洗脱液原花青素浓度（ｍｇ／ｍｌ）
１２０ １００ ８０ ６０ ４０ ２０
０ ０
２０％ 乙醇 ４０％ 乙醇 ５０％ 乙醇
１
２
３
４
５
６
图 ２ ＡＤＳ－８树脂解吸曲线
洗脱液体积（Ｂ Ｖ ）
朱靖蓉等：葡萄籽原花青素的分离纯化及其抗氧化活性研究
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・实验研究Experimental R esearch ・葡萄籽原花青素的梯度分离及其抗氧活性研究3Studies of G radient Extraction of G rape Seed Proanthocyanidin and Their Anti 2oxidative Effects杨怀霞Yang Huaixia 1,马庆一Ma Qingyi 2,许 闽Xu Min 11.河南中医学院Henan College of Traditional Chinese Medicine ;2.郑州轻工业学院Zhengzhou Institute of Light Industry摘要:目的:研究葡萄籽原花青素的梯度分离方法及各组分的抗氧化性能。
方法:葡萄籽样品通过乙醇粗提后,用不同溶剂梯度分离得到各组分,以乙酸乙酯组分为代表确定DPPH ・法测定活性的最佳浓度范围,再比较各组分自由基淬灭能力。
结果:最佳活性测定样品浓度范围1.0～10μg/ml ,运用此法测得的清除率在25%～80%之间,灵敏度和准确度较高;葡萄籽梯度分离各组分清除自由基能力:乙酸乙酯组分≥丙酮组分>乙醇组分>乙醚组分>乙醇粗提物>二氯甲烷组分>石油醚组分;其中乙酸乙酯组分和丙酮组分活性尤其突出,表明有高活性成分富集其中。
结论:梯度分离葡萄籽原花青素提取物的效果令人满意。
Abstract :Objective :To explore gradient extraction of grape seed proanthocyanidin and their antioxdative effect.Method :After sam 2ple grape seeds were extracted with ethanol ,the active components were obtained by application of different organic solvents.Through investigation of the free 2radical scavenging effect of ethylacetate components ,the optimum concentration range was deter 2mined by DPPH method and a comparison was made on the antioxidative effects of the different components from grape seeds.Re 2sult :The optimum assay range was 1.0～10ug/ml with the scavenging rate between 25%～80%.The sensitivity and accuracy of this method were satisfying.The free 2radical scavenging effects of different components from grape seed proanthocyanidin came in the following :Ethyl acetate >Acetone >Ethanol >Ether >the primary extracts of ethanol >Dichloromethane >Petroleum ether.A 2mong all components ,the activities of Ethyl acetate and Acetone extracts were excellent marked by the active components highly con 2centrated.Conclusion :Gradient extraction of grape seed proanthocyanidin was very promising.关键词:葡萄籽;梯度分离;抗氧化性;DPPH ・法K ey w ords :grape seed ;gradient extraction ;anti 2oxidative effect ;DPPH method中图分类号CLC number :R284.2 文献标识码Document code :A 文章编号Article ID :1672-6839(2004)05-0014-03 许多生理、病理现象都与体内自由基的产生和积累密切相关,寻找阻遏自由基反应的抗氧化剂的工作格外重要[1]。
近年来,植物源抗氧化剂由于其低毒、高效成为研究热点,葡萄籽中提取的原花青素更因其独特的抗氧化特性及高生物利用率倍受青睐,但因其组成复杂,各类成分之间性质相近,难以分离,极大地影响了有效成分的开发利用[2]。
DPPH ・法简便、快速、重现性好,广泛用于各种自由基清除剂筛选研究的分析跟踪[3]。
本文以梯度提取方法分离葡萄籽中的有效成分,以乙酸乙酯组分为代表确定DPPH ・法测定活性的最佳样品浓度范围,并对比了各组分的自由基淬灭能力,即其抗氧化活性的强弱。
该研究方法简便、有效,既为葡萄籽提取物的开发应用提供理论依据,也为其它同类研究提供参考。
1 实验材料材料:葡萄籽样品(民权葡萄酒厂下脚料)。
试剂:DPPH ・(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基,日本东京工业株式会社生产),原花青素标准品(Sigma 公司生产,含3基金项目:河南省教育厅科技攻关项目(编号:20023600010)量98%),其它试剂均为分析纯。
主要仪器:RE -52旋转蒸发器(上海安亭电子仪器厂),LD4-2离心机(北京医用离心机厂),752型紫外光栅可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),DZF -IB 型真空干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。
2 实验方法2.1 样品处理及有效成分分离提取取风干恒重的葡萄籽样品100g ,粉碎过20目筛,用700ml 80%乙醇浸泡过夜,水浴回流5h ,将提取液浓缩至粘稠油状,加入硅藻土拌匀,以滤纸包裹,移入索氏提取器,依次用石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等溶剂在避光下提取3h ,提取液减压浓缩后分别用乙醇定容记为A ,不溶部分用乙酸乙酯溶解后记为B 备用。
2.2 清除自由基活性试验(DPPH ・法)取0.20ml 样品溶液,加入4.00ml 的50μmol/L 的DPPH ・溶液混匀,放置30min ,以原溶剂调零点,在517nm处测吸光度记为Ai ,同法0.20mL 溶剂+DPPH ・溶液混匀测定吸光度记为Ac ;0.20ml 样品溶液+4.00ml 的溶剂混匀测吸光度记为Aj 。
按照以下公式计算自由基清除率:・41・2004年10月第5期No.5 Oct. 2004河南中医学院学报JOURNAL OF HENAN UNIVERSITYOF CHINESE MEDICINE 第19卷总第114期Vol.19Serial No.114IP (%)=[1-(Ai -Aj )/Ac ]×100其中Aj :反映样品自身对吸光度的贡献;Ac :为DPPH ・本身在测定波长的吸收;Ai :样品对DPPH ・作用后的吸光度数值。
2.3 样品用量选择与抗氧化活性测定先将乙酸乙酯组分A 部分用95%乙醇稀释为不同浓度,进行清除自由基活性试验以确定最佳样品用量,再分别用95%乙醇、乙酸乙酯稀释其它各组分A 、B 部分,取同样量进行样品活性测定。
2.4 原花青素含量测定采用香草醛-盐酸法[4],以原花青素为标准品作标准曲线,计算样品中原花青素含量。
2.5 薄层分析以甲苯∶丙酮∶醋酸=3∶3∶1体系展开,参考文献[5]进行分析。
表1 梯度提取各组活性测定结果%组分乙醇丙酮乙酸乙酯AB乙醚AB二氯甲烷AB石油醚乙醇粗提颜色暗红色棕红色红色红色红色红色黄绿色黄绿色灰绿色暗红色收率 1.0250.9610.1960.0010.2720.0040.1090.0050.326 3.050原花青素54.3358.6793.33101.0042.0040.319.070.000.0042.00IP86.4193.3393.5990.2485.9075.6135.904.884.5576.413 实验结果3.1 样品用量的选择乙酸乙酯组分A 部分用95%乙醇稀释为不同浓度,进行清除自由基活性测试结果见图1、图2。
图1 不同浓度样品的淬灭自由基活性测试图2 不同浓度样品的自由基清除率 图1的Aj -C 曲线显示:样品在测定波长517nm 下有吸收,并且随浓度的增加而增大,但当样品用量低于25μg/ml 时,Aj <0.005样品在测定波长下的吸收与测定值相比微不足道,毋须考虑样品本身对吸收度的贡献;从图2样品用量与清除率的关系看来,样品浓度0.25～10μg/ml 与清除率呈正相关关系;在样品加入浓度超过10μg/ml 时,自由基清除率在80%以上,此时若用量继续增加,清除率变化不大,且样品浓度过大,样品吸收使背景加深影响测定,在此浓度区间测定灵敏度和准确度都不高;而当C <1μg/mL 清除率小于25%测定结果的绝对误差会比较大,显然活性测定浓度范围1～10μg/ml ,清除率在25%～80%,对于比较各个组分的活性十分有利,方法灵敏度、准确度均较高。
3.2 样品测定葡萄籽样品梯度分离各组分加入浓度10μg/ml 的活性测定结果见表1。
显然:乙酸乙酯组分≥丙酮组分>乙醇组分>乙醚组分>乙醇粗提物>二氯甲烷组分>石油醚组分。
各组分活性与原花青素含量呈正相关的关系。
4 讨论由葡萄籽各级提取物的抗氧化性测定过程可以知道,判断物质的抗氧化效果,样品用量选取至关重要。
清除率与样品浓度呈正相关关系,在一定浓度范围内测定的灵敏度和准确度令人满意。
样品本身在测定波长的吸收不得不考虑,样品用量并非越大越好,其用量大到一定程度,样品活性强弱难以比较,如果用量太大,样品本身对吸收值的贡献远远超过它淬灭自由基所引起的吸光度值的减少(Aj >Ac -Ai ),样品本身的吸收会掩盖它对自由基的清除能力,由此还可能得出样品无抗氧化性或有助氧化作用的错误结论。
从梯度提取各组分的活性测定结果可见原花青素是主要抗氧化活性成分。
普遍地各组分的醇溶部分比乙酸乙酯溶解物的活性强,说明活性高的成分是水溶性好的原花青素低聚体,乙醇粗提物、石油醚组分、二氯甲烷组分、乙醚组分、乙醇组分的活性差异大,此样品用量可以明显地比较出它们清除自由基能力的差异。