规律成簇的间隔短回文重复序列Cas内切酶基因编辑技术及其在眼科研究进展解析
基于CRISPR Cas9技术的基因编辑研究进展
基于CRISPR Cas9技术的基因编辑研究进展基因编辑是一项近年来备受关注的生物技术，可以用于改变生物体的基因组。
CRISPR Cas9技术作为一种有效、精确的基因编辑工具，已经在科学界引起了广泛的兴趣和研究。
本文将对基于CRISPR Cas9技术的基因编辑研究进展进行介绍和探讨。
第一部分：CRISPR Cas9技术的原理CRISPR Cas9技术是一种基于细菌免疫系统的基因编辑工具。
CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，意为“聚集规律间隔短回文重复序列”。
Cas9意为“CRISPR associated protein 9”，是CRISPR系统中的一个核酸酶。
这个复杂的系统由一系列的Cas蛋白以及一段短的引导RNA（gRNA）组成。
CRISPR Cas9技术的原理是通过引导RNA与Cas9蛋白结合形成复合物，这个复合物能够识别并结合到目标DNA的特定序列上。
一旦与目标DNA结合，Cas9蛋白将其剪切，从而导致DNA的损伤。
细胞为了修复这种损伤而进行自然修复过程，这个过程往往会产生不完全的DNA修复或添加、删除DNA碱基对的突变，从而改变了基因组。
第二部分：基于CRISPR Cas9技术的基因编辑应用基于CRISPR Cas9技术的基因编辑已经在多个领域展示了巨大的应用潜力。
以下是一些主要的应用领域的简要介绍：1. 农业应用：CRISPR Cas9技术可以用于改良作物的性状，提高抗病性和产量。
通过编辑目标作物的基因组，可以使其更适应特定的环境条件或产生更高的营养价值。
2. 医学研究：CRISPR Cas9技术可以用于研究特定基因对人类健康和疾病的影响。
通过编辑人类干细胞或动物模型的基因组，可以模拟疾病的发生和发展过程，帮助科学家们更好地理解疾病的机制，并寻找治疗方法。
3. 遗传病治疗：基因编辑可以用于修复基因突变导致的遗传病。
生物工程师招聘面试题与参考回答(某大型国企)2025年
2025年招聘生物工程师面试题与参考回答(某大型国企)(答案在后面)面试问答题（总共10个问题）第一题题目：请解释基因表达调控的基本机制，并举例说明在实际应用中的重要性。
第二题题目：请简述您在生物工程领域的学习和研究经历，包括您参与的科研项目、您在其中承担的角色以及您认为最成功的一项成果。
此外，请说明这项成果对您个人成长和职业发展的影响。
第三题题目：请描述CRISPR-Cas9基因编辑技术的工作原理，并讨论其在生物医学研究中的潜在应用与伦理考量。
第四题请结合您以往的工作经验或学习经历，谈谈您对生物工程领域当前热点技术（如基因编辑、生物制药、生物传感器等）的理解，以及您认为这些技术在未来可能带来的影响和挑战。
第五题题目：请解释基因编辑技术CRISPR-Cas9的工作原理，并讨论其在医药领域中的潜在应用及伦理考量。
第六题题目：请谈谈您对生物工程领域当前发展趋势的理解，并结合您过往的工作经验，谈谈您认为在生物工程领域有哪些关键技术或研究方向具有广阔的应用前景？第七题题目：请描述CRISPR-Cas9基因编辑技术的工作原理，并讨论其在生物医学研究中的潜在应用及伦理考量。
第八题题目：请描述一次您在生物工程领域遇到的技术难题，以及您是如何克服这个问题的。
第九题题目：请解释一下CRISPR-Cas9基因编辑技术的基本原理，并讨论它在生物工程中的应用前景。
第十题题目描述：请您谈谈您对生物工程技术在环境保护领域的应用的理解，并结合具体案例，说明生物工程技术如何帮助解决某一具体环境问题。
2025年招聘生物工程师面试题与参考回答(某大型国企)面试问答题（总共10个问题）第一题题目：请解释基因表达调控的基本机制，并举例说明在实际应用中的重要性。
参考答案：基因表达调控是指细胞如何控制基因从DNA转录成RNA以及随后翻译成蛋白质的过程。
这一过程对细胞的功能至关重要，因为它决定了何时何地以及产生多少特定的蛋白质。
调控可以发生在多个层次上，包括转录前水平、转录水平、转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。
基因编辑技术CRISPRCas9的原理与方法探究
基因编辑技术CRISPRCas9的原理与方法探究CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，使科学家能够精确、高效地修改生物体的基因组。
这一技术源于细菌的免疫系统，CRISPR是“簇规律间隔短回文重复”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的缩写，Cas9则是CRISPR相关蛋白9的缩写。
CRISPR-Cas9技术的原理是通过引导RNA（sgRNA）的作用，将Cas9蛋白导向特定的DNA序列，然后通过Cas9的核酸酶活性切割靶标DNA，以实现编辑基因的目的。
具体而言，CRISPR-Cas9技术主要包括以下几个步骤：第一步：设计合适的sgRNA序列。
sgRNA是一段含有20个碱基的DNA片段，其中包含一个引导序列，用于与目标DNA序列互补结合。
第二步：制备sgRNA与Cas9蛋白的复合物。
sgRNA与Cas9蛋白形成复合物后，sgRNA将指导Cas9蛋白在细胞质内寻找与其序列互补的DNA。
第三步：与导向序列互补的DNA靶标结合。
sgRNA将Cas9蛋白导向到与其引导序列互补的DNA靶标上。
第四步：Cas9蛋白剪切DNA。
一旦Cas9蛋白与DNA靶标结合，其内在的核酸酶活性就会被激活，Cas9蛋白会向靶标DNA中剪切位置的特定位置引入双链断裂。
第五步：细胞修复机制介入。
细胞会尽可能修复切割的DNA，主要有两种修复机制：非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）和同源重组（Homology Directed Repair, HDR）。
通过以上步骤，科学家可以利用CRISPR-Cas9系统对特定DNA序列进行增加、删除或修改，从而实现基因组的精确编辑。
这项技术的突出优点在于其简单、高效、灵活和经济，相对于之前的基因编辑方法，CRISPR-Cas9技术更加容易操作，并且可以用于多种物种。
规律成簇间隔短回文重复序列
规律成簇间隔短回文重复序列回文序列是指正序和倒序相同的序列，如“level”、“racecar”等。
在基因组中，回文序列的存在对于维持基因组的稳定性和功能至关重要。
而研究回文序列的重复模式和分布规律，则有助于深入了解基因组的结构和演化。
近年来，研究人员发现了一种新型的回文序列重复模式，即规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。
CRISPR序列由一系列短回文序列（spacer）和重复序列（repeat）交替排列而成，其中spacer序列通常为外源DNA序列，如病毒、质粒等，而repeat序列则为基因组内部的保守序列。
CRISPR序列的发现，不仅为基因组的免疫系统提供了新的研究方向，也为基因编辑技术的发展提供了重要的理论基础。
CRISPR/Cas系统是一种基于RNA导向的DNA切割技术，可以精准地编辑基因组，被广泛应用于生物医学研究和治疗领域。
除了在基因组中的重要作用外，CRISPR序列的研究还揭示了一些有趣的现象。
例如，CRISPR序列的重复模式和分布规律在不同物种和不同环境中存在巨大的差异。
在某些细菌中，CRISPR序列的重复单元数目可以达到数百个，而在其他物种中则只有几个。
此外，CRISPR序列的分布也呈现出一定的空间规律，如在某些物种中，CRISPR序列倾向于分布在基因组的末端区域。
对于CRISPR序列的研究，不仅有助于深入了解基因组的结构和演化，也为基因编辑技术的发展提供了新的思路和方法。
未来，随着技术的不断进步和研究的深入，相信CRISPR序列的研究将会取得更加重要的进展，为人类的健康和生命科学的发展做出更大的贡献。
总之，规律成簇间隔短回文重复序列是基因组中一种重要的回文序列重复模式，其研究不仅有助于深入了解基因组的结构和演化，也为基因编辑技术的发展提供了新的思路和方法。
规律间隔成簇短回文重复序列(相关核酸酶系统)
规律间隔成簇短回文重复序列(相关核酸酶系统)规律间隔成簇短回文重复序列，这是一种与相关核酸酶系统密切相关的现象。
在这篇文章中，我们将生动地介绍该规律、探讨其全面性，并探讨其在生物学研究中的指导意义。
首先，让我们来了解一下簇短回文重复序列是什么。
簇短回文重复序列，简称CRISPR，是一种存在于细菌和古菌基因组中的特殊DNA 序列。
CRISPR序列通常由一系列短重复序列和间隔序列组成。
这些重复序列在细菌基因组中重复出现，而间隔序列则是独特的。
研究表明，CRISPR序列在抵抗外源DNA入侵方面起着重要作用。
相关核酸酶系统则是与CRISPR序列密切相关的一组蛋白质。
这些酶系统通过干扰外源DNA的复制和转录过程来保护细菌免受病毒等侵袭。
在这一过程中，CRISPR序列会记录并保留病毒DNA的信息，以便将来对抗同一病毒入侵。
研究人员发现，CRISPR序列中的间隔序列和短回文重复序列之间存在一种特殊的规律间隔。
这种规律间隔可以帮助科学家们更好地理解相关核酸酶系统如何工作，并为研发基因编辑和基因治疗等领域的技术提供指导。
这种规律间隔成簇的短回文重复序列在全球范围内广泛存在于细菌和古菌的基因组中。
通过研究不同细菌中CRISPR序列的多样性和演化，研究人员发现了许多有趣的现象。
比如，不同细菌中的短回文重复序列长度和间隔序列长度可能会有所不同，这为确定CRISPR序列的功能和机制提供了线索。
此外，CRISPR序列的规律间隔成簇现象也被应用于生物技术领域。
基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术如今已成为生物学研究和医学治疗中的重要工具。
通过设计特定的引导RNA，科学家们可以利用CRISPR-Cas9系统精确地编辑特定基因序列。
这项技术具有高度的准确性和效率，被广泛应用于基因治疗、作物育种等领域。
总之，规律间隔成簇的短回文重复序列与相关核酸酶系统密切相关，其对细菌抵抗外源DNA入侵起着重要作用。
这一规律不仅在科学研究中具有全面性，也在生物技术领域具有重要的指导意义。
CRISPRCas 基因编辑技术简介
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编码
的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段
不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重 复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat2s0).13年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著名杂 志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、小鼠
、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
第1页，共22页。
1.CRISPR/Cas系统概述
1.1CRISPR的分布与分类：
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至 少存在CRISPR 基因座。
根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分为3 中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多 个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系统只 需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是被改造的最成功的
第9页，共22ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
4.CRISPR/Cas9 系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链, 使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明,这条嵌 合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用的都是 crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
基因编辑技术的原理与应用
基因编辑技术的原理与应用基因编辑技术是一种通过改变生物体的基因组来进行基因修饰的方法。
它基于对基因组中特定基因进行精准修饰的原理，能够改变生物体的遗传特征，具有重要的科学研究和应用潜力。
基因编辑技术的原理主要涉及到三个关键组成部分：CRISPR （簇规律间隔短回文重复序列）、Cas蛋白和导向RNA。
CRISPR是一种出现在细菌和古菌的基因组中的一种特殊序列，具有重复和间隔的结构。
Cas蛋白则是一种与CRISPR序列相互关联且具有特定功能的蛋白质。
导向RNA是CRISPR-Cas系统中的一种RNA分子，能够识别和结合特定的靶基因序列。
当导向RNA与Cas蛋白相结合时，导向RNA能够引导Cas蛋白精确地靶向到与导向RNA相互匹配的靶基因序列，从而引发基因组的修饰。
基因编辑技术的应用非常广泛。
首先，基因编辑技术可以用于基础科学研究。
通过对不同生物体进行基因编辑，科学家可以研究不同基因在生物体发育和功能方面的作用，从而揭示生物体的遗传机制。
其次，基因编辑技术对于疾病治疗具有重要意义。
通过基因编辑，科学家可以修复患者体内存在的基因突变，从而治疗遗传性疾病。
例如，可以利用基因编辑技术修复患者体内存在的单核苷酸突变，从而消除遗传病的风险。
此外，基因编辑技术还可以用于改善农作物的品质和产量。
通过对农作物基因组进行编辑，可以增加农作物的抗病能力、耐旱能力和产量，从而提高农作物的生产效益。
然而，基因编辑技术也存在一些潜在风险和伦理问题。
首先，基因编辑技术可能会对生态环境产生不良影响。
由于基因编辑技术通常涉及到改变生物体的基因组，可能导致潜在的生态破坏。
其次，基因编辑技术涉及到对人类胚胎进行基因编辑的问题，引发了伦理争议。
在一些国家和地区，对人类胚胎进行基因编辑被视为违反伦理准则的行为。
因此，在应用基因编辑技术时，需要权衡技术潜能和伦理道德等诸多因素，确保技术的安全和合理性。
总之，基因编辑技术是一种具有重要科学研究和应用潜力的技术。
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用
基因编辑技术CRISPRCas的原理与应用基因编辑技术CRISPR-Cas的原理与应用基因编辑技术是一项革命性的科学技术，被广泛应用于生物学、医学及农业领域。
而CRISPR-Cas系统作为当前最被关注的基因编辑技术之一，引发了广泛讨论和研究。
本文将介绍CRISPR-Cas系统的原理，并探讨其在基因编辑和其他领域的应用。
一、CRISPR-Cas系统的原理CRISPR-Cas系统是一种原本存在于细菌和古细菌中的天然免疫系统。
它能检测到外源DNA，并将其与细菌基因组中的CRISPR序列进行匹配，进而实现基因序列的特异性识别和剪切。
CRISPR代表“簇规律间隔短回文重复”，主要由一系列短回文重复序列和间隔序列组成。
而Cas蛋白则是CRISPR-Cas系统的核心组成部分，它起到对外源DNA进行识别和切割的作用。
具体而言，CRISPR-Cas系统分为两个主要阶段：适应性和干预性。
适应性阶段：在细菌感染外源DNA时，一种特殊的酶将外源DNA片段插入到细菌基因组中的CRISPR序列中，形成“spacer”。
这一过程类似于免疫的“记忆”，使细菌“学会”了识别并攻击同种类的病毒或外源DNA。
干预性阶段：当同一种病毒再次感染细菌时，CRISPR序列中的spacer将被转录成RNA，并与Cas蛋白形成复合物。
这个复合物能够识别并结合目标DNA，在Cas蛋白的介导下，外源DNA将被剪切并失去功能。
二、CRISPR-Cas系统的应用1. 基因编辑CRISPR-Cas系统在基因编辑领域有着广泛的应用。
通过改变spacer 的序列，科学家可以设计指定的RNA引导序列，使CRISPR-Cas系统能够准确识别和切割特定的基因。
这样，人们可以实现对基因的精确编辑和修复。
基因编辑技术通过CRISPR-Cas系统的应用，带来了无数的可能性，包括遗传病的治疗、农作物的改良以及生物燃料的生产等。
2. 遗传学研究CRISPR-Cas系统也被广泛用于研究基因的功能与调控机制。
第三代基因编辑技术CRISPRCas9解析
新型疗法
不良反应： 细胞因子释放综合征
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）
基因编辑技术应用在 CAR-T 上的成功案例： Cellectis 公司UCART19
新型疗法
降低排异反应
TCR α
UCART19+TALEN
CD52
使细胞对阿仑单抗耐药，用于 CAR-T细胞筛选，提高筛选效率 和疗效
RQR8
CRISPR-P
CHOPCHOP GT-Scan
33
23 28
23-5000
不限 不限
/crispr
https:///index.php .au/gt-scan/submit
可增加细胞对利妥昔单抗的敏感性 降低副作用率，保证安全性
新型疗法
CRISPR /Cas9
CAR-T
2.0 Ver CAR-T
发展机会： 1. 具备 CRISPR 技术储备 2. 临床研究经验丰富
&
&
3. 靶点储备丰富 4. 免疫细胞储备
Thanks！
2016.8.27
CRISPR/Cas
(gRNA-Cas9): DNA 20nt crRNA (CRISPR RNA) fused to a tracrRNA and Cas9 endonuclease that recognize specific sequences to the base pair Easy: - all-in-one gRNA-Cas9 vector system - multi gene editing is feasible Mali et al., 2013 Cong et al., 2013 Jiang et al., 2015
基因编辑技术论文
CRISPR—Cas基因组改造技术研究进展郭嘉海1王奇奇2邹虎山3（1.生物技术1班学号：121303109，2.生物技术1班学号：121303110，3.生物技术1班学号：121303111）摘要：CRISPRs—Cas系统是一种细菌获得性免疫系统，为一段规律成簇间隔短回文重复，保护细菌和古生菌免遭病毒、质粒等的入侵。
这种免疫系统是由一种小RNA和多结构域蛋白质／蛋白复合物构成，其作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似。
这个系统已发展为一种高效、特异、操作简单易行的基因修饰工具，与TALEN、ZFN相比．CRISPR—Cas系统的出现使得基因编辑变得更加有效和简易，具有更大的潜力。
CRISPR／Cas系统已成功应用到细胞、干细胞、小鼠、斑马鱼及植物等多种生物，显示了其强大的基因编辑优点[1]。
综述了CRISPR—Cas系统的技术原理及其在生物学研究中的应用最新研究进展，并探讨了该技术的发展前景。
关键词：规律成簇间隔短回文重复(CRISPRs)；内切酶；同源重组机制；非同源末端连接机制；脱靶效应；Abstract：CRISPRs—Cas is the elucidation of the prokaryotic adaptive immune system and clustered regularly inter- spaced short palindromic repeats，which protects bacteria and archaea against viruses or conjugative plasmids．The immuni— tv svstem consists of bacteria RNA molecules and versatile multi—domain proteins or protein complexes，which may be simi— lar to the mechanism of RNA interferenee．CRISPR—Cas interfefence machines are utilized to develop into a genome edit — ing tools with efficiency，specialization and simplicity．Distinct from TALEN and ZFN，the CRISPR-Cas system has recent— ly emerged as a potentially facile and efficient alternative t001．Currently．researches have already modified the genome of cell，IPS，mouse，zebra，fish and plant with this system that show powerful ability to edit gene．The technical principles of CRISPR—Cas system and the latest progress on the application in biological study of CRISPR ／Cas system was reviewed，and the development future of the system was discussed．Key words：clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs)；endonuclease；homologous recombi— nation；non—homologous end joining；off-target effect.CRISPRs(Clustered regularly interspaced short pa—lindromic repeats)为规律成簇间隔短回文重复，是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构[2-3]。
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２０１４，３３７（３）：１９３—２０６．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｒｖｉ．２０１３．１１．０１１． Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ Ｍ，Ｋｏｈｎ ＤＢ，Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ
ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １３，２０１２
ａ
ｒａｒｅ
图１
ＣＲＩＳＰＲ
Ｃａｓ９十扰外源ＤＮＡ人侵示意图
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基【大｜编辑技术构建转基因动物运用于眼科研究克
传统的基因敲除技术需要经过几代约６个月至１年甚至
服了克隆数量有限物种局限的障碍。虽然这些应用具有广泛
前景，但ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术目前还未应用于大型动物 模型和人体上。
２．２
更长的时间才能获得单链或双链基因突变体，且随着代数增
高，其适用性不断减弱。将多种不同ｓｇＲＮＡ应用于同一 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统即可对不同位点同时进行基因改造，实现高 效，多通道基因编辑１。进行这种多位点ＣＲＩＳＰＲ／（’ａｓ基冈编 辑技术改造。费用低．灵活、高效且特异性强．更方便在模型动 物中大量研究某些特殊和罕见的基因突变。
２
ＣＲＩＳＰＲ疾病，可选择合适
的（、ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术对其基因突变进行精确及特异 性治疗。在体细胞基ＩＸＩ治疗中，眼科视网膜领域基因治疗最安
基金项目：国家９７３重大基础研究发展计划（２０１３ＣＢ９６７５００）
中图分类号：Ｒ３９４—３３
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ
ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ
ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ
ｒｅｐｅａｔｓ／Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ
ａｎｄ
ｉｔｓ
ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｎ
ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ
ｒｅｐｅａｔｓ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｏｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｅａｓｙ，ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｏｓｔ．Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｍａｋｅｓ ｉｔ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｍｕｔａｔｅ
在斑马鱼模型中，Ｏｔａ等”利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技 术敲除了斑马鱼胚胎中与视网膜色素上皮（ＲＰＥ）色素生成相 关基因ｇｏｌ和ｔｙｒ，发现在Ｆｏ代能有效产生低色素的表型，并将
这种表型遗传给后代。Ｃｈｒｉｓｐｅｌｌ等‘“。也分别利用ＺＦＮｓ、
靶序列互补配对，外源ＤＮＡ在配对的特定位置被核糖核蛋白
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａＩ
ＥＪ］．ＪＡＭＡ
ＤＯＩ：１０．１００１／ｊａｍａｏｐｈｔｈａｌｍ０１．２０１３．７６３０．
［３４】
Ｃｗｅｒｍａｎ—Ｔｈｉｂａｕｌｔ Ｈ，Ａｕｇｕｓｔｉｎ
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２０１４，１３２（４）：４０９—４２０．
（０Ｒ稿日期：２０１６—０１—０４）
（本文编辑：江影、唐健）
ｅｘｐｌｏｒｅ ｇｅｎｅ
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ；
Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（９７３ Ｐｒｏｇｒａｍ）（２０１３ＣＢ９６７５００）
许多疾病的基因组学高度复杂，涉及到基因的位点突变， 染色体异位、缺失或增多。为研究基因突变对疾病产生的影 响，需要有精确的模型动物。传统模型动物构建费时费力，步 骤繁琐，甚至需要操纵胚胎干细胞。同源重组技术是最早应用 在哺乳动物细胞中的基因敲除方法，随后逐渐发展了以 Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系统为基础的组织特异性基因敲除技术，并利用某些 标记基因对Ｃｒｅ诱导表达，实现基因敲除的时间调控［１］。而后 报道的可诱导区域性蛋白质敲除技术、锌指酶（ＺＦＮｓ）技术和
网膜基因敲除，运用电穿孑Ｌ转染视网膜细胞对基因进行改造。
２．１
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术在不同动物模型中的功能
研究
病毒或者噬菌体的获得性免疫防御分子．干扰是ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ 发挥抵御外源遗传物质入侵最关键的步骤。成熟的ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ与特异的Ｃａｓ蛋白形成核糖核蛋白复合物．能与外源
ＤＮＡ结合并扫描其靶序列．通过ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ的间隔序列与
【摘要】基因改造动物模型可用于基因的功能学研究，传统基因改造费时费力。规律成簇的间隔短回 文重复序列／Ｃａｓ内切酶基因编辑技术是一种新型的基因打靶技术，构建简单、方便且成本较低，能在单个 受精卵时期快速实现多个精确的靶基因突变，用于检测基因组中的基因表达和相互作用，明确基因功能。 目前该项技术虽处于研究的初步阶段，稳定性方面尚无定论；但因高效的基因改造效率，使得该项技术具有 较强的应用前景。通过建立合适的眼部疾病动物模型可以推动遗传性视网膜疾病的基因功能学研究，为基 因治疗在眼科领域的开展打下基础。 【关键词】基因打靶； 基因疗法；综述
转录激活因子样效应物核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）技术已实现体内基 因编辑，可使构建的模式动物在数分钟激活或敲除特定蛋白 质，极大提高了基因改造的效率［２’３］。近年发现的规律成簇的 间隔短回文重复序列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ内切酶（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）基 因编辑技术是一种新型的基因改造技术［４］，由于能高效改造哺 乳动物的基因组，在治疗空间特异性强的基因突变导致的遗传 性疾病中，ＣＲＩｓＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术具有很强的应用前景‘“。 现就ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术工作原理及其在眼科的研究
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在大鼠模型中。Ｂａｋｏｎｄｉ等。“一将含有ＳｐＣａｓ９和ｓｇＲＮＡ的 质粒电转入视网膜光感受器细胞．干扰含有Ｒｈｏ Ｓ３３４ｔｅｒ显性 突变的大鼠Ｒｈｏ基因．结果显示基因干扰阻止了视网膜变性，
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提高了视功能。 Ｈｏｎｇ等”“成功将红色荧光蛋白基凶转人狗胚胎成纤维 细胞，此后眼疾病动物模型逐渐应用转基因狗模型，包括 ＲＰＥ６５和先天性黑朦（Ｉ．ＣＡ）、色盲关系的研究。至此．运用
Ｄｉｎｇ Ｙｕｚｈｉ，Ｈｕ Ｚｉｚｈｏｎｇ，Ｙｕａｎ Ｓｏｎｇｔａｏ，Ｌｉｕ Ｑｉｎｇｈｕａｉ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａ｛｛ｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００２９。Ｃ＾ｉｎａ ＣｏｒｒＰｓ声ｏＨｄｉ雄ｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｌｉｕ Ｑｉｎｇｈｕａｉ，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｑｈ＠ｎｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｗｏｒｋｓｈｏｐ，
Ｊ １．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１３，２４（４）：３５５— ３６２．ＤＯＩ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１３．０６４．
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌｅｂｅｒ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ
ｇｅｎｅ
ｔｈｅｒａｐｙ
与调控．应用ＣＲｌＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术敲除Ｂ１０８后，Ｂｌｉｍｐｌ
的功能消失。Ｈｕｎｇ等”将靶向黄色荧光素蛋白ＹＦＰ的
ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９重组．以腺病毒为载体．经玻璃体腔注射导人 ７Ｆｈｙ卜ＹＦＰ转基因小鼠．５周后发现ＹＦＰ—ｓｇＲＮＡ改造组小鼠内 层视网膜ＹＦＰ荧光细胞的数量明显低于对照组。
ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｍａｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ； Ｒｅｖｉｅｗ
ａ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ
ｔｏ
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中华眼底病杂志２０１６年１１月第３２卷第６期Ｃｈｉｎ Ｊ
Ｏｃｕｌ Ｆｕｎｄｕｓ Ｄｉｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１６，Ｖ０１．３２，Ｎｏ．６
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ＵｓｈＳｔａｔ［Ｊ／ＯＩ。］．ＰＩ。ｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９（４）：９４２７２ ２０１４一０４—０４】．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｏｃ８８．ｃｏｍ／ｐ－７７３８２９５３７８６７７． Ｅ３５３
状况和生殖力不会产生改变，且能将改变的基因遗传给后代。 Ｗａｎｇ等”将含有干扰Ｂｌｉｍｐｌ基因功能的化脓性链球菌Ｃａｓ９ 质粒通过电转入幼鼠视网膜，观察幼鼠体内调节视杆细胞和双
ＲＮＡ序列（ｓｇＲＮＡ），可以识别保守的间隔相邻基序．对ＤＮＡ 进行双链剪切（图１）”１１”。被剪切的双链通过两种方式进行修
万方数据
中华眼底病杂志２０１ ６年１１月第３２卷第６期Ｃｈｉｎ Ｊ
Ｏｅｕｌ Ｆｕｎｄｕｓ Ｄｉｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１ ６．Ｖ０１．３２．Ｎｏ．６
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进展作一综述。
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科基础研究中，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术首先应用于眼部视
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术工作原理 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ最初在链球菌细胞内发现‘“，作为一种抵抗
复合物切割。间隔序列由俘获的外源ＤＮＡ组成，记录外源遗
ＴＡＩ．ＥＮｓ和ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ基因编辑技术对斑马鱼幼体进行基
因改造。
传物质入侵顺序，类似免疫记忆．当含有同样序列的外源ＤＮＡ 入侵时，可被细菌机体识别．并进行剪切使之表达沉默，达到保 护自身安全的目的。…。ＣＲＩＳＰＲ，／Ｃａｓ系统有３种类型，其中
Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅ
Ｓ，Ｅｌｌｏｕｚｅ
规律成簇的间隔短回文重复序列／Ｃａｓ内切酶基因编辑技术 及其在眼科研究进展
丁瑜芝 胡仔仲 袁松涛 刘庆淮