第五章.分子生物学的研究方法-电泳、杂交

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分子生物学研究方法
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3. 溶液III：3mol／L NaAc（pH4.8）溶液(质粒DNA）
调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定 存在。
高盐有利于染色体DNA、RNA（中和核酸上的电荷）以及 SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀（钠盐与SDS－蛋白复合物作用 后，能形成较小的钠盐形式复合物）。
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分子生物学
重组DNA技术的一般步骤
目的基因获得 功能研究 转化载体
转入受体细胞
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第一节 DNA基本操作技术——一、 DNA提取分离
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组织
提取液 离心
上清液
无水乙醇 离心
沉淀 TE 溶液
RNase
1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用
technology): 按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，
再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中稳 定地增殖、表达，以大量获得相关基因的产物 或新品种新产物。
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2.克隆（clone):
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指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全 相同的子代群体。
分子克隆（molecular cloning）：构建DNA重组体 并导入宿主细胞建立无性繁殖体系。
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二、核酸的凝胶电泳
1.基本原理 2.琼脂糖凝胶电泳 3.脉冲电场凝胶电泳
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1 原理
➢电泳及迁移率
+
➢核苷酸链为多聚带电阴离子
➢无反应活性的稳定的介质
➢电泳迁移率
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2 琼脂糖凝胶电泳
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琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂
分离DNA片段的大小范围（bp）
50 000～1000 20 000～1000 6 000～300 1000～100 500～25 50～1
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分子生物学 电泳槽结构
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电泳装置
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指示剂 常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.
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中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固， 密度由浓度决定的。
分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶
分辨 范围为0．2～50kb之间.
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不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力
凝胶类型及浓度
0.3％琼脂糖 0.7％琼脂糖 1.4％琼脂糖 4.0％琼脂糖 10％琼脂糖 20％琼脂糖
溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和 2%琼脂糖凝胶电泳中，迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、 0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。
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二甲苯青:水溶液呈兰色，在 1%和1.4%琼脂糖中 迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似.
6．RNase、SDS与KAc/饱和酚、氯仿：SDS可使RNase成为 SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更 小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物。 7．T-E缓冲液:DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。 磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等都可 作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子与Ca2＋产生 Ca3(PO4)2沉淀. 8.Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统:不存在金属离子的干扰作 用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓 冲液中的EDTA更能稳
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（二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础
DNA分子的切割与连接技术
DNA序列分析
载体构建和大肠杆菌转化体系的建立
Southern杂交、和聚合酶链式反应、核酸凝 胶电泳。。。。
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重组DNA技术的定义及步骤
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（一）重组DNA技术 1、重组DNA技术（recombinant DNA
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序：重组DNA技术回顾
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重组DNA技术的诞生 （一）重组DNA技术诞生的理论基础 1. 40年代明确了遗传的物质基础是DNA
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2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制
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分3、子5生0年物学代末和60年代:“中心法则”、操纵子学说、破西译北遗师传大密生科院 码
4．无水乙醇沉淀DNA：一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇 与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用 95％乙醇。
5．NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25 mol/L： 中和DNA分子 上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
序：重组DNA技术回顾 第一节 DNA基本操作技术 第二节 RNA基本操作技术—RNA提取 第三节 DNA与蛋白质互作 第四节 基因组技术 第五节 蛋白质组技术 第六节 基因克隆技术
DNA提取分离 核酸的凝胶电泳 PCR基因扩增 基因定点诱变 核酸序列分析 核酸分子杂交 DNA分子切割与连接
方法：加入凝胶中，凝胶浸泡
指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液. ①增加样 品密度. ②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核 酸电泳的速度和位置. ③使样品呈色，加样操作更方便
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光
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溴化乙锭染色
溴化乙锭（ethidium bromide，简称 EtBr）在一切可能的部位同DNA分 子结合，却不能同琼脂糖凝胶或聚丙 烯酰胺凝胶结合,并在300nm紫外光照 射下放射出橘红色的光，可显现凝胶 中0.05ug的微量DNA
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等，抑制脱氧核糖核酸酶；（2）有 利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
SDS：（1）溶解膜脂质与蛋白。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）与蛋 白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性。