SNP开发验证的研究方法和技术路线
开发SNP标记的方法
我们使用比对软件BWA（Li, H. and Durbin, R., 2009）将clean reads比对到参考基因组，使用Mem将clean reads比对到参考基因。
一般而言，比对率越高，表明测序的样本与参考物种的亲缘关系越近。
比对率低可能由于测序样品同参考物种相似度低，或者有其他污染造成。
童超波老师2016/3/24 17:07:27
1. SNP检测结果
根据BWA比对结果BAM文件，利用samtools、Picard-tools和Reseqtools对比对结果进行处理（排序、去重复、加ID等），然后应用GATK的unifiedGenotyper完成样品的个体SNP检测。
在一致序列（即经比对后获得的样本的所有SNP信息）的基础上，将检测到的基因型与参考序列之间存在多态性的位点进行过滤，得到高可信度的SNP数据集。
疾病相关基因SNP的分析与验证
疾病相关基因SNP的分析与验证随着技术的不断发展，生物信息学研究也日渐深入。
其中，SNP（单核苷酸多态性）成为研究生物学、药理学和医学中最重要的基因变异类型之一。
SNP分析已经成为了检测疾病和药物代谢的重要方法，而在研究人类遗传学和疾病相关基因中，SNP的应用更是不可或缺。
1. SNP的概念和分类SNP，即单个核苷酸的变异，也被称为基因突变或是基因多态性。
SNP是由单个碱基的变异所引起，通常在全基因组中有约1%的概率。
SNP被广泛应用于评估个体对疾病的易感性、药物代谢和肿瘤发生等领域。
SNP按照其在基因组中的位置分类，可分为外显子SNP、内含子SNP和调控SNP。
外显子SNP指的是存在于基因的外显子区域，可以直接影响蛋白质序列的结构和功能；内含子SNP存在于外显子和调节区域之间，通常对基因功能的影响较小；调控SNP存在于基因调节区域，可以影响基因的转录和表达，进而影响基因的功能。
2. SNP的分析SNP的分析通常包括三个步骤：SNP检测、基因型鉴定和统计分析。
其中SNP 检测是最为关键的一步，目前主要的检测技术有PCR-RFLP法、MassARRAY、SNP-PCR等。
在SNP检测的基础上，需要对检测结果进行基因型鉴定。
常见的基因型鉴定方法有PCR引物延伸分析、限制性片段长度多态性分析、基因芯片以及测序等。
最后，需要进行统计分析。
在统计分析中，最常用的是卡方检验和连锁不平衡分析。
卡方检验被广泛应用于检测基因型频率和疾病之间的关联性，而连锁不平衡分析则可以确定SNP之间的互连性。
3. SNP的验证SNP验证是保证SNP检测结果准确可靠的重要步骤。
SNP验证通常包括三个方面：测序验证、多样性验证和遗传流行病学验证。
测序验证是指通过测序对SNP检测结果进行验证。
这种验证方式直接检测SNP并确定其具体的位置和变异。
然而，测序验证的成本较高，时间较长，因此不适合高通量的SNP检测。
多样性验证是指将SNP检测结果与其他不同个体的SNP检测结果进行比较，以此确认SNP检测结果的可靠性。
SNP开发验证的研究方法和技术路线
SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记：分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。
现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。
即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP 标记。
1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。
可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。
在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。
在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。
目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。
而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。
但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。
番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。
另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。
因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。
虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。
总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。
即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。
1.2全基因组SNP—Douglas：当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，页脚内容1我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。
SNP技术及发展和应用
• SNP技术概述 • SNP技术的分类 • SNP技术的发展趋势 • SNP技术在生物科学研究中的应用
• SNP技术在医学诊断中的应用 • SNP技术在农业科学研究中的应用
01
SNP技术概述
定义与特点
定义
SNP，即单核苷酸多态性，是指在基 因组水平上由单个核苷酸的变异所引 起的DNA序列的遗传变异。
特点
SNP具有普遍性、稳定性、遗传性等 特点，是遗传学和基因组学研究中的 重要遗传标记。
SNP技术的历史与发展
起源
20世纪70年代，科学家开始发现 SNP的存在。
发展历程
随着基因组学和生物信息学技术 的不断进步，SNP检测技术逐渐 发展成熟，并广泛应用于遗传学、 医学和生物信息学等领域。
未来展望
随着测序技术的不断革新，SNP 检测将更加快速、准确、自动化， 有望在更多领域发挥重要作用。
精准治疗
根据个体的基因变异情况，制定个性 化的治疗方案，提高治疗效果和减少 副作用。
04
SNP技术在生物科学研究中的 应用
遗传学研究
遗传疾病关联分析
通过SNP技术分析遗传疾病与基因变 异之间的关系，有助于深入了解疾病
的发病机制和遗传基础。
人类进化研究
利用SNP技术分析不同人群的基因变 异，揭示人类进化的历史和迁徙路线。
定义
单碱基替换型SNP（也称为二等位基因型SNP）是指 基因组中单个碱基的变异引起的基因型变化。
特点
这种类型的SNP通常只涉及一个碱基的替换，导致相 应氨基酸的改变，进而可能影响蛋白质的功能。
检测方法
通过直接测序或基于Taqman探针的SNP分型技术进 行检测。
插入或缺失型SNP
SNP分析原理方法及其应用
SNPs检测方法
1.理想的检测SNPs的方法 的方法
——发现未知的SNPs，或 或检测已知的SNPs
(1) 灵敏度和准确度的要求 (2) 快速、简便、高通量 高通量、自动化 (3) 费用低廉
动脑筋的技术活，有意思 有意思，有趣，形式万变; 掌握基本原理,本质不离其中 本质不离其中
SNP分析原理方法及其应用 分析原理方法及其应用
卢大儒 复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室
遗传分析内容
n
基因组: 染色体水平 DNA水平 基因突变 重复 重复, 缺失, 倒位,重排 甲基化 基因组不稳定 基因组不稳定 多态性: SNP STR, CNV
SNPs（single nucleotide polymorphisms) single nucleotide polymorphisms)
wt/w t wt/m
m/m
DNA序列上单个碱基对的置换、插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化 插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化
突变（Gene Mutation)
单核苷酸多态（SNP）
n<0.1% n<0.1% n生殖细胞或体细胞
n150% n生殖细胞
SNP及检测技术
SNP及检测技术1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常见的一种。
占所有已知多态性的90%以上。
SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。
但通常所说的SNP 并不包括后两种情况。
单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。
所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。
从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。
SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。
依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。
理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。
因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。
基因组survey的数据snp位点开发
基因组survey的数据snp位点开发
基因组survey的数据，包括SNP位点，是通过高通量测序技术来开发的。
这些技术可以同时检测整个基因组中的大量位点，包括SNP。
开发SNP位点数据需要对样本进行DNA测序，然后使用计算方法进行数据分析，以确定哪些位点是SNP。
这些数据可用于研究遗传学、疾病关联和基因组进化等领域。
具体来说，基因组survey的数据开发过程大致如下:
1.样本收集: 首先需要收集大量的DNA样本，这些样本可以来自
人类、动物或植物等生物。
2.DNA测序: 接下来对样本中的DNA进行测序。
目前，最常用的
测序技术是高通量测序技术，如NGS（next-generation
sequencing）。
这些技术可以同时检测整个基因组中的大量位
点。
3.数据分析: 测序得到的数据需要进行分析。
首先，使用软件将原
始数据进行质量控制和过滤，然后使用计算方法进行数据分析，确定哪些位点是SNP。
4.数据整理: 最后将分析得到的SNP数据整理成数据库或文件，供
研究人员使用。
这些数据可用于研究遗传学、疾病关联和基因组进化等领域。
需要注意的是，这是一个简化的过程描述，在实际操作中，还需要考虑很多其他因素，如数据格式、数据管理、数据可视化等。
snp研究方法
snp研究方法一、基因分型技术。
这可是研究snp的常用手段哦。
比如说聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR RFLP），它的原理就是利用特定的限制性内切酶来识别和切割DNA序列。
要是某个snp位点刚好改变了内切酶的识别位点，那切割出来的片段长度就会不一样啦。
通过电泳分析这些片段，就能知道不同个体在这个snp位点上的基因型啦。
举个例子哈，假如我们要研究某个基因上的snp与某种疾病的关系，就可以用PCR RFLP技术把不同病人和正常人的DNA样本进行分析，看看这个位点的基因型分布有没有啥差异。
还有一种叫TaqMan探针法的基因分型技术也挺厉害的。
它是基于荧光共振能量转移原理的。
简单来说，就是设计两种不同的荧光标记探针，分别与snp位点的不同等位基因特异性结合。
在PCR反应过程中，只有与目标等位基因完全匹配的探针才能被激活，发出荧光信号。
这样通过检测荧光信号，就能快速准确地确定样本的基因型啦。
就好比给每个等位基因都贴上了一个独特的荧光标签，一下子就能把它们区分开来，是不是挺酷的呀？二、DNA测序技术。
这个方法可是研究snp的“金标准”哦。
通过直接测定DNA序列，我们就能准确地知道snp位点的具体信息啦。
现在常用的测序技术有一代测序、二代测序和三代测序。
一代测序也就是桑格测序法，它的准确性非常高，能够精确地测定较短的DNA片段序列。
不过呢，它的通量比较低，成本也相对较高，不太适合大规模的样本检测。
比如说，我们要研究一个小样本的特定基因区域的snp，用一代测序就挺合适的。
二代测序技术就不一样啦，它具有高通量、低成本的优点。
能够同时对大量的DNA片段进行测序，适合大规模的snp研究。
像全基因组关联研究（GWAS）这种需要分析大量样本的项目，二代测序就大显身手啦。
它就像一个高效的扫描仪，一下子能把很多DNA序列都扫出来，然后通过生物信息学分析，就能找到那些有意义的snp位点啦。
三代测序技术则更先进啦，它不仅能测序长片段的DNA，还能直接检测DNA的甲基化等修饰信息。
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SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记：分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。
现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。
即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间的分子标记，尤其是SNP标记。
1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。
可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。
在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。
在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。
目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。
而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。
但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。
番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。
另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。
因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。
虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。
总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。
即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。
1.2全基因组SNP—Douglas：当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。
3）对于一些高信息量，均匀分布在全基因的SNP分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。
因此，一套完整能够与Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。
图1.1 QTL区间上的SNP标记分布图注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。
1.3 Douglas系统下SNP标记的开发通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化PCR反应体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。
全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。
同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。
1.3.1 供试材料：22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（None Template Control），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。
以上实验在Q6仪器上进行。
对于筛选获得的一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上验证。
1.3.2 DNA提取：1. 取~10mg 植物组织，加入研磨介质和400μl 裂解液，研磨5min，3000g 离心5min。
2. 加入裂解液1/3 体积的提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于-20℃冰箱中）5min，于4℃，3200×g 离心10min，吸取上清300~400μl 加入到样品板中。
3. 按照下表在各96 孔板中加入试剂：板号板型板名成分样品及试剂体积1 Microtiter deep well96plate 样品板（Lysis）样品反应液无水乙醇300~400μl400μl2 Microtiter deep well96plate 洗涤板I（W1）PW磁珠800μl30μl3 Microtiter deep well96plate 洗涤板II（W2）80%乙醇磁套800μl4 KingFisher 96 KF plate 洗脱板（Elution）TE1.0 50~100μl4. 将各96 孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序。
5. 程序运行结束后，将DNA 溶液转移PCR 板中并测量浓度（>100ng/μl），进行后续实验或于-20℃保存待用。
1.3.3 分子标记命名：分子标记全部采用统一的命名规则，这样有利于结果的修改与维护。
例如：引物合成：由生工公司负责引物合成。
1.3.4 SNP分子标记的开发：最近，Sim等人利用番茄的Illumina芯片检测410份自交系与16份番茄品种的基因型。
本研究在此基础上，利用Illumina开发的7,720条探针序列，选择其中丢失频率小于10%，等位基因频率大于10%的探针序列，获得~3,500条探针序列，作为SNP引物开发的模板序列（），每条序列的长度为~100bp，SNP 上下游各50bp。
初期，我们可以从~3500条探针中，选取~120探针序列作为模板发展引物，这120条序列要求分布在12条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。
如果实验成功，我们可以逐步地将剩余的探针序列发展成为SNP引物。
1.3.5正向引物设计：由于我们需要使用KASP基因分型检测试剂盒，本试剂盒对正向引物已经确定为SNP位点上游~20bp（包括SNP位点），同时需要人工加上FAM或是HEX序列（图1.2）。
因此，我们需要单独设计反向引物。
图1.2 正向引物设计1.3.6反向引物设计：利用Primer3.0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下：1 引物长度为18~25bp；2 GC含量为40~60%；3 TM值58~62°C。
如果其上述模板序列不足以满足引物开发的需要：我们可以利用剩余~4,200条探针，继续开发新的引物。
另外，我们还可以利用PCR产物测序的方式获得gap中序列，寻找新的SNP位点。
1.3.6 PCR反应：PCR反应体系：PCR反应体系需要保证均一化，这样可以满足将来在Douglas 系统下进行SNP检测。
初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在Douglas系统中进行。
Primer Mix反应体系：名称体积（μl）FAM-Primer 12HEX-Primer 12Reverse-Primer 30ddH2O 46Total 100PCR反应体系：名称体积（μl）Reaction Mix 2.5Primer Mix 0.7ddH2O 0.8DNA 1Total 51.3.7 PCR反应程序：我们的PCR产物应该都为<100bp，因此我们可以采用统一设定，保证均一化。
采用两步法进行PCR反应，前期筛选引物我们设计3个复性梯度：60°C、57°C 以及55°C，以便找到最合适的复性温度。
首先，利用60°C的复性温度进行筛选：步骤参数意义1 25°C 1:30min 反应前收集荧光2 94°C 10min 预变性3 94°C 15s 变性4 60°C 1min 复性，延伸5 3-4重复40个循环6 25°C 1:30min 反应完收集荧光如果SNP引物在60°C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在60°C 复性进行PCR反应。
如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用57°C 进行复性。
57 °C复性温度PCR反应程序筛选：步骤参数意义1 25°C 1:30min 反应前收集荧光2 94°C 10min 预变性3 94°C 15s 变性4 57°C 1min 复性，延伸5 3-4重复40个循环6 25°C 1:30min 反应完收集荧光如果SNP引物在57°C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在57°C 复性进行PCR反应。
如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用55°C 进行复性。
最终，如果55°C复性温度时，反应结果不好，则该SNP引物剔除去掉。
55°C复性温度PCR反应程序筛选：步骤参数意义1 25°C 1:30min 反应前收集荧光2 94°C 10min 预变性3 94°C 15s 变性4 55°C 1min 复性，延伸5 3-4重复40个循环6 25°C 1:30min 反应完收集荧光1.3.8 SNP分子标记准确性验证：对于已在21份模板DNA扩增稳定的SNP引物，需要进一步在大群体中验证其稳定性、一致性、多态性。
选择84份番茄自交系或品种的DNA，通过相同的PCR方法，验证新开发的SNP分子标记。
1.3.9目标要求：番茄全基因组SNP标记：在番茄的全基因上，我们获得1200对特异的SNP 引物（平均100对/染色体）覆盖番茄的全基因组。
已获得在12份模板DNA能够稳定扩增的SNP分子标记，全部保留。
2分子标记辅助育种：2.1 ILs群体：如果利用现在群体不再进一步构建亚群体，ILs群体（L pennellii渐渗系群体）~76个自交系，整个群体数目较小，不利于定位及QTLs验证（图2.1）。
但是对于这些材料的渗入片段都已经注视清楚，因此我们可以直接比较深入系与M82自交系的表型差异，如果存在显著性差异，则可以定义为有深入片段引起的表型差异。
当鉴定结果与已定位的QTLs信息一致时，我们就认为此QTL在区间。
同时我们要检索此QTL定位时的位置，以此为基础发展SNP标记，用于以后分子标记辅助育种。
对于每个QTL的区间，需要发展4~8个SNP标记覆盖其定位区间（图1.1），其中，区间外两段各一个标记，部2~6个SNP标记。
这样可以保证目标QTL被完整的应用。
SNP标记的开发，此时的SNP标记只需要在ILs群体的两个亲本中有多态性就可以应用。
引物设计同全基因组SNP引物设计相同。
性状验证：对于确定的QTLs，我们需要开发对应的SNP标记，利用这些标记重新验证定位结果：图2.1 深入系材料的基因型2.2IBLs群体：IBLs群体本身就是分离群体，因此可以直接用作定位（图2.2）。
如果该群体基因型已经被鉴定，我们可以直接利用鉴定的基因型结合我们自己调查的表型，获得QTL初定位的结果。
同时，利用Affymetrix芯片进行全基因组的SNP 检测，然后与表型数据相结合进行分析。