单克隆抗体和基因工程抗体的制备优秀课件
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单克隆抗体与基因工程抗体的制备讲解84页PPT
单克隆抗体与基因工程抗体 的制备讲解
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
谢谢！
பைடு நூலகம்
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
谢谢！
பைடு நூலகம்
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
单克隆抗体和抗体工程ppt课件
培养液中也不能增殖而很快死亡。
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30
3、杂交瘤细胞
骨髓瘤细胞HGPRT-，TK 既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨
髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。 在HAT培养液中，选择性存活下来，并不
断增殖。
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31
浆细胞自 发或诱发
突变
脾B细胞用 SRBC免疫(注
射X蛋白)
Fab：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链 和重链恒定区。CL和CH1之间以二硫键连接；
保存有抗原结合活性和特异性。保留VH和VL 即可完全获得原抗体的抗原结合活性，Fv
Fc：两条重链的CH2和CH3区域，二硫键连 接，没有抗原接合活性，但是抗体结合上抗原 后激活免疫反应的主要部位。
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还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌 的杂交瘤细胞株，
缺点：
小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化
带来难度。
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42
大量培养方法：
利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂 交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提 高。
连续悬浮培养的细胞密度可达2.0107细胞 /ml，收集的单克隆抗体可达到400g/ml左 右。
1984年：人-鼠嵌合抗体 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分
子过大的问题得以解决，可仅作为与抗 原特异性结合试剂。
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3、杂交瘤细胞
骨髓瘤细胞HGPRT-，TK 既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨
髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。 在HAT培养液中，选择性存活下来，并不
断增殖。
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31
浆细胞自 发或诱发
突变
脾B细胞用 SRBC免疫(注
射X蛋白)
Fab：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链 和重链恒定区。CL和CH1之间以二硫键连接；
保存有抗原结合活性和特异性。保留VH和VL 即可完全获得原抗体的抗原结合活性，Fv
Fc：两条重链的CH2和CH3区域，二硫键连 接，没有抗原接合活性，但是抗体结合上抗原 后激活免疫反应的主要部位。
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还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌 的杂交瘤细胞株，
缺点：
小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化
带来难度。
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42
大量培养方法：
利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂 交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提 高。
连续悬浮培养的细胞密度可达2.0107细胞 /ml，收集的单克隆抗体可达到400g/ml左 右。
1984年：人-鼠嵌合抗体 1984年至今：单克隆抗体的鼠源性及分
子过大的问题得以解决，可仅作为与抗 原特异性结合试剂。
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高二生物选修三《单克隆抗体的制备》课件
单 点
击
击 此
处
添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理（离心、振荡、 电刺激）
化学（聚乙二醇）
获得杂种植株
物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
．
○
．．
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 （
源 ：
淋 巴 细 胞 ）
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 ：
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__（__浆__细_ 胞） 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一 个Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
击
击 此
处
添 添
加 副
加 标
题
标 题
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
去除细胞壁后诱导 原生质体融合
使细胞分散后诱导 细胞融合
诱导方法 用途
物理（离心、振荡、 电刺激）
化学（聚乙二醇）
获得杂种植株
物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒
主要用于制备 单克隆抗体
○
三
二一
．
○
．．
浆来 。结的抗概 抗
二 、
B
细 胞 （
源 ：
淋 巴 细 胞 ）
合 的 具
、 并 能
体 是 机
念 ：
体
有与体
单 克
免该受 疫抗抗
隆
功原原 能发刺
抗
的生激 球特后
体
蛋异产
白性生
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的 原因是 每__一__种__B_淋__巴__细__胞__只__能__分__泌__一__种__特__异__性__抗体
3.产生抗体的细胞是_效__应__B_细__胞__（__浆__细_ 胞） 产生单克隆抗体的细胞是杂__交__瘤__细__胞__
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一 个Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单 一的。
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
《基因工程抗体》PPT课件
在嵌合抗体的基础上进一步将 鼠 MAb 可 变 区 中 相 对 保 守 的 FR(framework region)替换成人的FR， 保留与抗原结合部位决定簇互补区 （complement determinant region) 部位 (即CDR移植)
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行微 调即更换某个位点上的氨基酸。
理想的抗体药物的性质
高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排 斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准
抗体治疗存在的问题及对策
问题
对策
异源蛋白导致产生抗抗体，• 抗体人源化 影响靶向性和效果
2 开创人类抗体基因组学的研究 评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在
PNAS 2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会
未来单抗开发的完美方案
从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体 全人抗体挑战靶分子的筛选 开发未知抗原的治疗用抗体
已批准上市的单抗
适用病症 移植排斥 大肠癌 冠心病
AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白 质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列 中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构 象和免疫原性的新型抗体。
今后抗体药物发展的方向
寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物
最理想的单克隆抗体 100%人源 人类免疫系统自然产生
功能：具有较好的抗原结合能 力，且分子量小、穿透力强、免 疫原性低等特性。可与其他效应 分子构建成多种具有新功能的抗 体分子，是构建免疫毒素和双特 异抗体等的理想而基本的元件 。
早期的改型抗体：
简单的CDR移植，通过点突变进行微 调即更换某个位点上的氨基酸。
理想的抗体药物的性质
高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M） 对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排 斥反应 游离抗体不激活补体 一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能 细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养 抗体符合生物制品标准
抗体治疗存在的问题及对策
问题
对策
异源蛋白导致产生抗抗体，• 抗体人源化 影响靶向性和效果
2 开创人类抗体基因组学的研究 评 价：1 诺贝尔奖得主Dr Milstein 推荐发表在
PNAS 2 世界权威杂志“科学”发表了新闻评述 3 剑桥大学开了新闻发布会
未来单抗开发的完美方案
从已知治疗靶子生产高亲和力全人抗体 全人抗体挑战靶分子的筛选 开发未知抗原的治疗用抗体
已批准上市的单抗
适用病症 移植排斥 大肠癌 冠心病
AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白 质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列 中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构 象和免疫原性的新型抗体。
今后抗体药物发展的方向
寻找新的靶抗原 基于抗原立体结构设计抗体 基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗 体模拟物
最理想的单克隆抗体 100%人源 人类免疫系统自然产生
功能：具有较好的抗原结合能 力，且分子量小、穿透力强、免 疫原性低等特性。可与其他效应 分子构建成多种具有新功能的抗 体分子，是构建免疫毒素和双特 异抗体等的理想而基本的元件 。
单克隆抗体与基因工程抗体制备
ATGA
酶切位
点
上游引物：HF1>5’ CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3’>
下游引物：HF2>5’ GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3’>
限制性内切酶
限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末 端或平端的外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应。
基因工程的操 作技术
1、体外基因重组
目的基因的制备
载体的构建：质粒或
噬菌体
目的基因与载体重组
2、重组体DNA的转 化增殖和表达 转化 筛选 增殖和基因表达
Foreign DNA to be inserted
+
Plansmid vector Joining
Recombinant DNA molecule
酸，通常为A。因此，Taq DNA聚
合酶扩增的产物可与 T-载体进行 粘端互补连接，达到高效克隆的 目的。因为TA克隆法操作最简单， 快速和高效的原因，成为Taq聚合 酶PCR产物的最佳克隆方法。
试剂与器材
1、材料：纯化的PCR产物 2、试剂 （1）LB液体培养基 （2）1.5%琼脂LB固体培养基 （3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷（X-gal）储存液(20mg/mL) （4）异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG）储液(20mg/mL) （7）pEASY-Blint载体系统 3、仪器
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
最新单抗与基因工程抗体精品课件
基因工程抗体
(Genetic engineering antibody)
概念：
根据研究者的意图，采用基因工程方 法，在基因水平，对免疫球蛋白基因 进行切割、拼接或修饰后导入受体细 胞进行表达，产生新型抗体。主要包 括 嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、 双价抗体和双特异性抗体。
一. 嵌合抗体(chimeric antibody)
从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基 因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当 表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌 合抗体。
特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性， 同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的 能力。
二. 单链抗体(single chain antibody)
用基因工程方法，将抗体重链和 轻链可变区通过一个连接肽连接而 成的重组蛋白。
特点：能保持与抗原结合的性能， 分子量小，穿透性强，体内循环半 衰期短，免疫原性低。
单链抗体的应用：
用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体：在细胞内表达特异性
识别某一基因产物的抗体，可干扰该基 因产物的生物活性。 1. 4。研究基因结构与功能的关系
三. 人源化抗体(humanized antibody)
将识别肿瘤抗原的抗体和 识别 细胞毒性免疫效应细胞表面分子的 抗体连结在一起，可使效应细胞更 容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀 伤肿瘤细胞的作用。
五 .单克隆抗体在医学上的应用
（一）用作诊断试剂 1. 检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化
阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2. 鉴定病原体，准确诊断传染病。 3. 用于肿瘤的诊断和分型 4. 激素类单抗用于测定体内激素含量，判
断内分泌的功能状态
Hale Waihona Puke （二）用作研究工具纯化抗原 分析和探查抗原结构 分析抗原决定簇分子的功能
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
（二）免疫脾细胞选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，多用腹腔内或皮内多点注射法。
如微量抗原，可脾脏内直接注射进行免疫。
（三）细胞融合PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中不能增殖。
3.杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞与脾细胞融合，获得HGPRT，可以利用次黄嘌呤合成DNA，故可以存活。
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存单个细胞培养又称克隆化。
细胞克隆化一般至少进行3～5次。
克隆化有以下几种方法：（一）有限稀释法操作简单，出现率高，为实验室最常用的方法。
（二）显微操作法直观可靠，但操作时间过长，容易增加污染机会。
（三）荧光激活细胞分选仪先进、高效、高纯度、昂贵。
（四）软琼脂平板法本法缺点是琼脂融化温度较难掌握，过高会导致细胞死亡，过低使细胞分布不均匀，操作较复杂，克隆出现率不稳定。
杂交瘤细胞应及时冻存，以保证细胞不会因污染或过多传代变异丢失染色体而丧失功能。
目前均采用液氮保存细胞。
（注意逐步降温、快速复温）第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生（一）动物体内诱生法目前McAb治疗用或体外诊断用的多采用该法。
《基因工程抗体》PPT课件
（三）单链抗体（single-chain antibody
） • 又称FV分子。
• 目的：基因工程手段构建更小的具有结合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单链抗体 蛋白。
• 本质：是由VL区氨基酸序列与VH区氨基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。此外肽 连接物还可将药物、毒素或同位素与单链抗体蛋白相融合。
优点
• 这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋白的免疫原性较低；在血清中比完整的单 克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清除；无Fc片段，体内应用时可避免非特异性 杀伤；能进入实体瘤周围的微循理：可将抗体分子的部分片段（如V区或C区）连接到与抗体无关的序列上（如 毒素），就可创造出一些Ig相关分子
• 催化抗体制备技术的开发预示着可以人为生产适应各种用途的，特别是自然界不存在 的高效催化剂，对生物学、化学和医药等多种学科有重要的理论意义和实用价值。
（二）催化抗体的制备
• 催化抗体（抗体酶）技术是化学和免疫生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物 ，是将抗体的极其多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新 方法，故而显示出较高的理论和实用价值，成为酶工程领域中的研究热点。
2. 导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链 3. 再将小鼠杂交瘤细胞的Ig VL基因与人的CL基因相连 4. 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 5. 筛选分泌鼠－人嵌合抗体的骨髓瘤细胞
所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分 泌的抗体特异性和亲和力相同，但减 少了抗体中的鼠源性成分
（二）重构抗体（reshaping anti body）
基因工程抗体
（genetic engineering antibody）
• 随着DNA重组技术以及其它分子生物学技术的发展，人们利用基因工程技术来制备抗体 分子，这种抗体分子称为基因工程抗体，这是分子水平的抗体。
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三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养
杂交瘤细胞形成的初期很不稳定， 鼠的二倍体细胞有40对染色体，杂交后 80对，易丢失，丢失后仍生长，要检测 上清液中是否有目的抗体及淋巴因子。
•
1. 稳定、易培养
•
2. 自身不分泌Ig或CK
•
3. 融合率高
•
4. 是HGPRT缺陷株
目前常用的BALB/c小鼠B细胞瘤株有P3X63-Ag8.653C （ P3.653 ） 、 Sp2/0 等 。 为 HAT敏感株，易培养, 融合率高，最常选用 聚乙二醇(PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容 易融合。
•
• 小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技 术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率 较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳 定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的 染色体。
二、T 细胞杂交瘤
自 B 细胞杂交瘤技术后，T 淋巴细胞 杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深 入地研究T细胞的各种功能，虽然有一些小 鼠T细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意， 该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性， 一种T细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子， 到目前仍无突破性进展。
一、B 淋巴细胞杂交瘤技术
细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和 小鼠骨髓瘤细胞。B细胞能产生抗体， 但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞 不产生抗体但在体外能长期生长，二者 融合，各保持其本性，既产生抗体又长 期生长。
其原理分为几个步骤
（一）细胞的选择与融合
目的是制备抗原特异的 McAb，所 以融合的细胞必须经抗原免疫的B细胞， 通常取脾，另一是在体外长期生长又 不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发 性骨髓瘤细胞，具备以下特点：
（二）选择培养基的应用
细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可 能出现以下情况:
1）脾细胞与瘤细胞 2）瘤细胞与瘤细胞 3）脾细胞与脾细胞 4）未融合的脾细胞 5）未融合的瘤细胞 6）多聚体形式。 3）、4）、6）在体外易死去，不需筛选。
细胞的 DNA 合成一般有两条途径 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物 合成核苷酸，进一步合成 DNA，叶酸是 重要辅酶。
T 淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人， 由于 T 细胞功能的多样化，制备出的 T 细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋 巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因 子，自身反应性等。其基本过程是将激 活的T细胞与酶缺陷型T淋巴细胞瘤细胞 融合，可表达特异性 TCR 或其他功能 的杂交瘤T细胞，与 B 细胞相以，但细 胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳 定，简介主要步骤 。
1. 淋巴瘤细胞系的选择 1）体外无限制快速生长 2）融合率高 3）不分泌淋巴因子和杀伤功能 4）缺乏某一特异性表面抗原或受体 5）HGPRT 酶缺陷型
2.特异性T细胞的制备与纯化主要有 可溶性抗原诱导激活的 T 细胞、同种反 应性T 细胞、人的特异性 T 细胞。
3.T 细胞杂交瘤的筛选
通常在含有HAT选择培养基上， 用特异性抗体筛选产生淋巴因子的 杂交瘤细胞，用抗 CD3-TCR 抗体筛 选阳性细胞。
• 单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原 结合部位完全相同，生物活性专一，特异性 强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大 量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比 较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植 及自身免疫病等。
第一节 杂交瘤技术的基本原理
基本原理是融合的两种细胞保持 自身的特性，产生具有原来两个细 胞基因信息的单个核细胞称为杂交 细胞。包括B细胞、T细胞，前者产 生Ig，后者产生CK。
计数，每个孔只放一个细胞，实际是0 至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞 株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细 胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培 养或动物接种。
• 另外还有其他杂交瘤技术，如人-人 B 淋巴细胞杂交瘤和鼠-人 B 淋巴细胞杂 交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难， 生长不稳定，有的分泌 IgE，有的分泌 Ig 的γ、κ链。B细胞取外周血淋巴细胞、 脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细 胞。从理论上讲很好，但实际比较困难， 在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获 得抗原特异性B淋巴细胞；人杂交瘤细胞 不能在小鼠或其他动物体内生长。
一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺 嘧啶存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 （hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRT）和 胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase,TK）的催化作用合成 DNA。
氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶 呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合 的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌 呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤 (aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷 (thymidine,T)，三者取前缀缩写为 HAT 培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经。
所以，前面提到的 2）瘤细胞与瘤细 胞及 5) 未融合的瘤细胞不能生长，只有 1） 脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为
HGPRT 阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤 阻断的主要途径。
（三）有限稀释与抗原特异性选择
在免疫动物时，一种抗原往往有多个表 位 ，一个B细胞克隆接受一个表位，故在 免疫动物时是众多 B 细胞克隆的抗体的分 泌，而针对目的抗原的B细胞只占很少部分 ，在细胞融合后，有相当一部分是无关的 细胞融合体，即融合细胞分泌的不是目的 抗体，要进行筛选，分二步稀释。
单克隆抗体和基因工程抗体的 制备优秀课件
目的要求 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理 2. 熟悉单克隆抗体的制备技术 3. 熟悉基因工程抗体技术
概述
大多数抗原分子具有多个抗原决定 簇（表位，epitope）。一个抗原决定 簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性 抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗 体称为多克隆抗体（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一个 只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody,McAb)。