单克隆抗体和基因工程抗体的制备

二、小分子抗体 具有结合抗原功能的分子片段称为小 分子抗体。其优点：1）可在原核细胞表 达，生产成本低; 2）易于穿透血管或组 织到靶细胞部位，有利于疾病的治疗；3） 不含Fc 段，副作用小；4）半衰期短，有 利于毒素中和及清除。
小分子抗体包括：抗原结合片段 （fragment of antigen binding,Fab）， 可变区片段（fragment of variable region,Fv）,单链抗体（single chain Fv,ScFv），单区抗体。另有VH和VL。
一、B 淋巴细胞杂交瘤技术 细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和 小鼠骨髓瘤细胞。 B 细胞能产生抗体， 但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞 不产生抗体但在体外能长期生长，二者 融合，各保持其本性，既产生抗体又长 期生长。
其原理分为几个步骤
（一）细胞的选择与融合 目的是制备抗原特异的 McAb ，所 以融合的细胞必须经抗原免疫的B细胞， 通常取脾，另一是在体外长期生长又 不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发 性骨髓瘤细胞，具备以下特点：
1.
淋巴瘤细胞系的选择
1）体外无限制快速生长 2）融合率高 3）不分泌淋巴因子和杀伤功能 4）缺乏某一特异性表面抗原或受体 5）HGPRT 酶缺陷型
2. 特异性 T 细胞的制备与纯化主要有 可溶性抗原诱导激活的 T 细胞、同种反 应性T 细胞、人的特异性 T 细胞。
3.T 细胞杂交瘤的筛选 通常在含有HAT选择培养基上， 用特异性抗体筛选产生淋巴因子的 杂交瘤细胞，用抗 CD3-TCR 抗体筛 选阳性细胞。
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小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技 术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率 较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳 定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的 染色体。
二、T 细胞杂交瘤
自 B 细胞杂交瘤技术后，T 淋巴细胞 杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深 入地研究T细胞的各种功能，虽然有一些小 鼠T细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意， 该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性， 一种T细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子， 到目前仍无突破性进展。
三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 杂交瘤细胞形成的初期很不稳定， 鼠的二倍体细胞有 40 对染色体，杂交后 80 对，易丢失，丢失后仍生长，要检测 上清液中是否有目的抗体及淋巴因子。
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将阳性细胞进行单细胞培养，反复2～ 3次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及 时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变 异或污染，冻存于液氮（-196℃）,冻存时 加小牛血清至20%, 加几滴10%二甲亚砜。 • 杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、 接种动物腹腔。
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1. 2. 3. 4.
稳定、易培养 自身不分泌Ig或CK 融合率高 是HGPRT缺陷株
目前常用的BALB/c小鼠B细胞瘤株有P3X63-Ag8.653C （ P3.653 ） 、 Sp2/0 等 。 为 HAT敏感株，易培养, 融合率高，最常选用 聚乙二醇 (PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容 易融合。
氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶 呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合 的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌 呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤 (aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷 (thymidine,T)，三者取前缀缩写为 HAT 培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒 性培养基选择出来的 HGPRT 阴性细胞株。
（四）双特异性抗体 双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb）又称双功能抗体。两个抗 原结合部位具有不同的特异性，可以同时 与两种不同特异性抗原发生结合。
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1.化学交联BsAb 分别分离纯化两种抗原的单抗，先使 Ig解离后，获得单价抗体，再使两种不同 抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来 。该方法易致抗体失活，其产物也难以保 证均质性。
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2. 体外培养 较常做，用普通培养瓶培养，根据培 养时间、细胞生长情况收取上清液。另有 高密度培养，在单位体积内增加细胞的培 养数量。
二、单克隆抗体的纯化
腹水或细胞上清液，均含有脂蛋白、脂 质及细胞碎片等杂质，用滤纸去掉脂质和大 颗粒，离心去除细胞碎片和蛋白聚合物。
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目前纯化方法有十几种，一般采用盐 析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取 等，现在最有效的方法是亲和纯化法，常 用 SPA 或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交 联。称为 Sepharose 柱，抗体结合上去，然 后洗脱。
( 二 ) 改 形 抗 体 （ reshaped antibody,RAB）
应用基因工程技术在嵌合抗体基础 上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗CDR 以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单 抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化 抗体，该抗体对人无免疫原性。
（三）抗体的表面修饰
人和鼠 IgV区来自不同的种属，轻链不同型 别 ， 互 补 性 决 定 区 (complementarity determining region,CDR) 的 长 度 可 不 一 致 ， 但暴露于表面的 AA 残基的位置数量都很保守， 通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区 的异源性，将 Fv 的表面人源化，消除其免疫原 性而不影响 Fv 的整体空间构象。
三、单克隆抗体的性质鉴定 鉴定的方法很多，用已知抗原测 定抗体，几乎所有的抗原抗体反应 试验都可以作，如阳性，再定量， 确定工作浓度。
第三节 基因工程抗体技术
杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、 预防和蛋白质提纯应用中非常广泛， 但对人是异源性，人抗小鼠抗体， 应用基因工程技术减少小鼠源成分， 保留原有的抗体特异性。
T 淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人， 由于 T 细胞功能的多样化，制备出的 T 细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋 巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因 子，自身反应性等。其基本过程是将激 活的T细胞与酶缺陷型T淋巴细胞瘤细胞 融合，可表达特异性 TCR 或其他功能 的杂交瘤T细胞，与 B 细胞相以，但细 胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳 定，简介主要步骤 。
所以，前面提到的 2）瘤细胞与瘤细 胞及 5) 未融合的瘤细胞不能生长，只有 1） 脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为 HGPRT 阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤 阻断的主要途径。
（三）有限稀释与抗原特异性选择
在免疫动物时，一种抗原往往有多个表 位 ，一个 B 细胞克隆接受一个表位，故在 免疫动物时是众多 B 细胞克隆的抗体的分 泌，而针对目的抗原的B细胞只占很少部分 ，在细胞融合后，有相当一部分是无关的 细胞融合体，即融合细胞分泌的不是目的 抗体，要进行筛选，分二步稀释。
将载体 DNA 导入真核细胞称为转染。 导入的 DNA 整合至细胞基因组 DNA 中 得到转染子，要得到稳定的转染子需利 用真核细胞的显性选择标记基因，这些 标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质 的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒 物质可杀死转染不成功的细胞，达到选 择的目的。
3.表达
用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少， 而应用二氢叶酸还原酶（ dhfr ）扩增系统使抗 体表达增强。dhfr 是正常核酸代谢必须的酶， 缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞（ CHO ））需在有 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷条件下利用 DNA 合成， 因此 , dhfr 作 CHO 的显性选择标记基因，在 无次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情况下，只有导 入 dhfr 基因，细胞才能存活。该糸统可用来 扩增导入的目的基因。
1.鼠单克隆抗体可变区基因克隆 用探针从该杂交瘤细胞的基因组文 库 中 调 取 。 用 PCR 方 法 从 该 细 胞 的 RNA 中扩增 VH 及 VL 基因。
2. 表达载体的构建
人 - 鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区 基件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括 细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复 制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性 标记基因。
第二节 单克隆抗体的制备技术
McAb 单一、特异、纯化，利用杂交 瘤技术制备McAb的基本原理是三个原则： 1）一种单克隆产生一种抗体 2）杂交瘤细胞保持双亲细胞特性 3）筛选培养基
一、单克隆抗体的产生
1. 动物体内生长
杂交瘤细胞注射同系小鼠腹腔，先 注射石蜡或不完全佐剂，使腹腔渗出液 增多，1～2周后无菌方法抽取腹水，离 心取上清。
1. Fab 由一条完整的 L 链和约为1/2的 H 链组成，是完整抗体的 1/3，只有一个 Ag 结合位点，它是将 McAb 重链V区和 CH1 区cDNA 与完整轻链 cDNA 连接，在 细胞启动子的控制下分泌表达。
第四章 单克隆抗体与基因 工程抗体的制备技术
中南大学湘雅医学院检验系 临床微生物学免疫学教研室 李闻文 2013 ,10
目的要求 1. 掌握杂交瘤技术的基本原理
2. 熟悉单克隆抗体的制备技术
3. 熟悉基因工程抗体技术
概 述
大多数抗原分子具有多个抗原决定 簇（表位，epitope）。一个抗原决定 簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性 抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗 体称为多克隆抗体（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一个 只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生 的同源抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody,McAb)。
计数，每个孔只放一个细胞，实际是 0 至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞 株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细 胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培 养或动物接种。
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另外还有其他杂交瘤技术，如人-人 B 淋巴细胞杂交瘤和鼠-人 B 淋巴细胞杂 交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难， 生长不稳定，有的分泌 IgE，有的分泌 Ig 的γ 、κ 链。B细胞取外周血淋巴细胞、 脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细 胞。从理论上讲很好，但实际比较困难， 在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获 得抗原特异性B淋巴细胞；人杂交瘤细胞 不能在小鼠或其他动物体内生长。