单克隆抗体的制备及应用.doc
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法是通过以下步骤来实现的：
1. 免疫原的选择：选择一个目标抗原，并将其注入到免疫宿主中，例如小鼠。
2. 免疫应答：免疫宿主的免疫系统会识别并产生抗体来应对免疫原的存在。
3. 融合细胞的制备：从免疫宿主中取得抗体产生的细胞，并与癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞的筛选：采用适当的培养基，筛选出那些能够生存和增殖的杂交瘤细胞。
这些细胞具有与原先抗体产生细胞相同的生长特性。
5. 单克隆抗体的筛选：将培养基中的每个细胞与免疫原进行反应，然后用酶联免疫吸附试验（ELISA）或流式细胞术等方法筛选出特异性抗原结合的细胞。
6. 单克隆抗体的扩增：将特异性抗原结合的细胞分离并培养，使其增殖，形成一个与原始细胞相同的细胞群。
除了以上的制备原理，还可以使用其他的方法来制备单克隆抗体，例如基因工程方法、人源化方法等。
这些方法可以通过人工改造的方式来制备单克隆抗体，以满足特定需求。
免疫学研究中单克隆抗体的制备及其在疾病预防和治疗中的应用
免疫学研究中单克隆抗体的制备及其在疾病预防和治疗中的应用中文版：免疫学研究中单克隆抗体的制备及其在疾病预防和治疗中的应用单克隆抗体(mAb)是由单一的淋巴细胞克隆所产生的抗体，是目前广泛应用于疾病预防和治疗的一类生物制品。
单克隆抗体具有高特异性、高亲和力以及高度稳定性等优点，因此研究和开发单克隆抗体已成为生物制品领域的热点之一。
本文将简要介绍单克隆抗体的制备原理及其在疾病预防和治疗中的应用。
单克隆抗体的制备原理制备单克隆抗体的基本原理是从一个淋巴细胞中获得特异性单一的抗体基因并进行扩增，从而得到大量相同的单克隆抗体。
其过程包括以下几个步骤：1. 免疫原选择首先需要选择合适的免疫原，一般采用纯化的蛋白质、多肽或者病毒、细胞等生物体的整体或部分结构。
此外，也可以利用人工合成的类似物或其他不同来源的物质进行免疫原选择。
2. 免疫反应将免疫原注射到动物体内，动物的免疫系统便会针对该免疫原产生相应的抗体。
这个过程需要仔细控制免疫原的种类、用量和注射方式等因素，以确保获得高效的及特异性的免疫反应。
3. 细胞融合将免疫细胞和肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞(Hybridoma)。
该过程需要注意克隆合适的融合细胞和免疫细胞，以保证融合后的细胞能够稳定分泌特异性的单克隆抗体。
4. 筛选与鉴定对杂交瘤细胞进行筛选和鉴定，以获得产生高效的单克隆抗体的细胞株。
筛选方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术、免疫组化等多种方法。
5. 生产和纯化选优的杂交瘤细胞株进行大规模生产，获得相应的单克隆抗体。
此外，还需要对其进行充分的纯化和质量分析等，以保证单克隆抗体的稳定性和高纯度。
单克隆抗体在疾病预防和治疗中的应用单克隆抗体广泛应用于疾病预防和治疗领域，其疗效与其优越的结构和性质密切相关。
在疾病预防中，单克隆抗体可用于对特定细菌、病毒等病原体的识别和清除，从而预防感染和疾病的发生。
目前已经有多种单克隆抗体用于疾病预防，其中包括白喉疫苗、流感疫苗等。
单克隆抗体的制备及应用实验原理
单克隆抗体的制备及应用实验原理1. 简介单克隆抗体是指由单一B细胞克隆扩增得到的抗体，在医学研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法及其在实验中的应用原理。
2. 单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备需要经历以下几个步骤：2.1 免疫原的选择免疫原的选择是单克隆抗体制备的第一步。
通常选择与所需抗体结构最为相似的蛋白质作为免疫原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白、细胞表面抗原等。
2.2 免疫动物的免疫选择适当的免疫动物，常见的包括小鼠、大鼠、兔子等。
将免疫原与免疫佐剂混合注射到动物体内，触发免疫反应，使得免疫动物产生特异性抗体。
2.3 细胞融合将免疫动物的脾细胞和癌细胞进行融合，常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞等。
通过融合方法，使得脾细胞和癌细胞融合成为杂交瘤细胞。
2.4 杂交瘤细胞的筛选与培养对融合后的杂交瘤细胞进行筛选，常用的方法包括喷洒法、限稀稀释法等。
筛选出具有单克隆性的杂交瘤细胞后，进行培养、扩增。
2.5 单克隆抗体的纯化将培养得到的杂交瘤细胞进行离心、洗涤等操作，得到含有目标抗体的上清液。
通过柱层析、电泳等方法，对上清液进行纯化，最终得到单克隆抗体。
3. 单克隆抗体的应用实验原理单克隆抗体在实验室中有多种应用，包括免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
以下将介绍单克隆抗体在这些实验中的应用原理：3.1 免疫组化免疫组化是一种检测组织或细胞中特定抗原表达情况的方法。
通过与组织或细胞中特定分子结合，单克隆抗体可以为我们提供目标抗原的定位和分布情况。
3.2 免疫印迹免疫印迹是一种检测特定蛋白质表达情况的方法。
通过将蛋白质转移到膜上，并与特异单克隆抗体结合，可以用于检测目标蛋白质的存在与定量。
3.3 流式细胞术流式细胞术是一种用于分析和鉴定细胞表面标记物的方法。
通过与特定抗原结合，单克隆抗体可以进行标记，并通过流式细胞仪进行检测和分析。
3.4 免疫沉淀免疫沉淀是一种用于富集目标蛋白质的方法。
抗cd19单克隆抗体及其制备方法与应用
抗cd19单克隆抗体及其制备方法与应用抗CD19单克隆抗体及其制备方法与应用导言抗CD19单克隆抗体是一种生物医学领域中重要的药物，它被广泛应用于白血病、淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤的治疗。
本文将以从简到繁、由浅入深的方式，探讨抗CD19单克隆抗体的制备方法和应用，并对其意义进行深入的阐述。
1. 抗CD19单克隆抗体的概念及意义1.1 CD19及其在肿瘤中的表达CD19是一种胞内成熟B细胞特异性膜表达抗原，广泛存在于人体的B淋巴细胞表面。
CD19的过表达与多种恶性肿瘤的形成和发展相关，因此成为药物研发领域的重点关注对象。
1.2 抗CD19单克隆抗体的定义和作用机制抗CD19单克隆抗体是针对CD19抗原的高亲和力和特异性单克隆抗体。
其作用机制主要包括直接抗肿瘤细胞杀伤、细胞依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬等。
由于其选择性作用于CD19阳性的恶性肿瘤细胞，抗CD19单克隆抗体被广泛应用于白血病、淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤的治疗，并展现了显著的临床疗效。
2. 抗CD19单克隆抗体的制备方法2.1 免疫原的选择和制备制备抗CD19单克隆抗体的第一步是选择合适的免疫原。
在这里，我们选择具有高亲和力和特异性的CD19蛋白作为免疫原。
该蛋白可以通过表达系统的构建和纯化获得。
2.2 动物模型的制备在制备抗CD19单克隆抗体的过程中，需要将免疫原注射到合适的动物模型中，以激发其免疫系统产生特异性抗体。
常见的动物模型包括小鼠、大鼠和兔子等。
2.3 单克隆抗体的制备和筛选将免疫小鼠的脾细胞与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞。
利用杂交瘤细胞进行单克隆抗体的产生和筛选。
对单克隆抗体的产生和筛选过程要求严格，以确保单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 抗CD19单克隆抗体的应用3.1 白血病和淋巴瘤的治疗抗CD19单克隆抗体在白血病和淋巴瘤的治疗中表现出非常显著的疗效。
它可以选择性地杀伤CD19阳性的恶性肿瘤细胞，同时保留正常细胞的功能，减少了传统放化疗给患者带来的副作用。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 The latest revision on November 22, 2020单克隆抗体的制备及应用单克隆是由杂交瘤产生的、只针对复合上某一单个。
技术(monoclonalantibodytechnique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1单克隆抗体的优点与局限性：1.1单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA 等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。
1.2单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与、细胞融合、选择杂交瘤细胞及检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是一种由单一克隆B细胞产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
它在生物医药领域有着广泛的应用，包括疾病诊断、治疗和生物学研究等方面。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法，希望能对相关领域的研究人员有所帮助。
一、制备原理。
单克隆抗体的制备原理主要包括以下几个步骤，抗原免疫、细胞融合、筛选和鉴定、扩增和保存。
首先，通过将目标抗原注射到实验动物体内，诱导其产生特异性抗体。
然后，从免疫动物体内获得B细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
接着，通过细胞培养和筛选，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
最后，对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
二、制备方法。
1. 抗原免疫。
选择合适的实验动物，根据抗原的特性和研究需要，选择合适的免疫方案，包括抗原的种类、免疫的途径和次数等。
2. 细胞融合。
将获得的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的筛选条件包括杂交瘤细胞的生长条件、培养基的成分和杂交瘤细胞的筛选方法等。
3. 筛选和鉴定。
通过特异性抗原的筛选和鉴定，筛选出产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。
鉴定的方法包括ELISA、免疫印迹、免疫荧光等。
4. 扩增和保存。
对所得的单克隆抗体进行扩增和保存，以备进一步的实验和应用。
扩增的方法包括体外培养、动物体内生长等。
三、实验注意事项。
在进行单克隆抗体的制备过程中，需要注意以下几个方面的实验注意事项，实验动物的选择和管理、抗原的制备和纯化、细胞融合和杂交瘤细胞的培养条件、单克隆抗体的鉴定和保存等。
四、应用前景。
单克隆抗体作为一种重要的生物医药制剂，在疾病诊断、治疗和生物学研究等方面具有广阔的应用前景。
随着生物技术的不断发展，单克隆抗体的制备技术也在不断完善，相信在未来会有更多的应用领域被开发出来。
综上所述，单克隆抗体的制备原理及方法是一个复杂而又具有挑战性的过程，需要研究人员在实验操作中严格把关，以确保所得的单克隆抗体具有高度的特异性和亲和力。
单克隆抗体的制备方法与应用
单克隆抗体的制备方法与应用一、前言单克隆抗体是指一种具有高度特异性和亲和力的抗体，其来源于单个B细胞克隆。
相比多克隆抗体，单克隆抗体更加纯净、稳定和可靠，因此在生物医学研究、诊断和治疗等方面有着广泛的应用。
本文将介绍单克隆抗体的制备方法与应用。
二、单克隆抗体的制备方法1. 免疫动物首先需要选取适当的动物进行免疫，通常选择小鼠或大鼠。
在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
2. 免疫原选择选择合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键步骤。
常见的选择包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。
在选择时需要考虑到其特异性、稳定性和可重复性等因素。
3. 免疫程序在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。
接着，将免疫原注射到动物体内，通常需要多次免疫以增强免疫效果。
在免疫过程中需要对动物进行监测，例如采集血样检测抗体水平。
4. 融合细胞的制备在获得足够的抗体后，需要从动物体内采集B细胞并与骨髓瘤细胞进行融合。
常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。
5. 单克隆抗体筛选通过限稀法或单一细胞分离法等方法将融合细胞分离为单个克隆，并通过ELISA、免疫印迹等方法筛选出特异性较高的单克隆抗体。
接着对筛选出的单克隆抗体进行扩增和纯化等处理。
三、单克隆抗体的应用1. 生物医学研究单克隆抗体在生物医学研究中有着广泛的应用，例如作为特定蛋白质或分子的检测工具、用于药物开发和治疗等。
2. 诊断单克隆抗体在诊断方面也有着重要的应用，例如用于肿瘤标志物的检测、病原体的检测等。
3. 治疗单克隆抗体在治疗方面也有着广泛的应用，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。
其中一些单克隆抗体已经被批准为药物并用于临床治疗。
四、总结单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，在生物医学领域中有着广泛的应用。
其制备方法包括适当动物选择、合适免疫原选择、多次免疫程序、融合细胞制备和单克隆抗体筛选等步骤。
说明单克隆抗体的制备原理及其商业化产品的应用
单克隆抗体的制备原理及其商业化产品的应用一、单克隆抗体的产生与概念抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。
单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。
淋巴细胞杂交瘤是用人工方法使骨髓瘤细胞（纯系小鼠的腹水瘤型浆细胞）与已用抗原致敏并能分泌某种抗体的淋巴细胞（常用致敏动物的脾细胞，起作用的是其中的B 细胞）融合而成的。
用来使上述淋巴细胞致敏的抗原有人和动物的T细胞、B细胞、红细胞、肿瘤细胞、各种微生物或其他抗原物质等。
用适当方法把杂交瘤细胞分离出来，进行单个细胞培养，使之大量繁殖，则在该培养液中增殖而形成的细胞克隆，只产生完全均一的、单一特异性的抗体，即单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
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单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。
单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1 单克隆抗体的优点与局限性：1.1 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。
1.2 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2 单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
2.1 抗原准备抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。
抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。
很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。
2.2动物的选择与免疫2.2.1 动物的选择纯BALB/c小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活目开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/c小鼠。
2.2.2免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。
一般在融合前两月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml，0.2ml/点），3周后第二次免疫，剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml），3周后第三次免疫，剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价），2～3周加强免疫，剂量50～500μg宜，ip或iv （静脉内注射)，3天后取脾融合。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip，2～3周后，第二次免疫1×107/0.5ml ip，3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv，取脾融合。
2.3 细胞融合2.3.1细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生量McAb。
骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml 为宜，最大浓度不得超过106/ml。
当细胞处于对生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。
每3～5天传代一次。
细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HA T呈均一的敏感性。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。
在制备McAb 的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。
常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。
饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
2.3.2 细胞融合的步骤①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。
轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。
37℃水浴作用90s。
③加37。
C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④离心，800rpm, 6min。
⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。
一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。
⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
2.4 选择杂交瘤细胞及抗体检测2.4.1 HAT选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。
在HA T选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HA T选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。
在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。
2.4.2 抗体的检测检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。
（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。
（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
2.5杂交瘤克隆化杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。
因为经过HA T筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。
在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。
要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。
克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。
即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。
2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏2.6.1 杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。
因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。
如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。
细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。
冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。
也可用细胞冻存装置进行冻存。
冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
2.6.2 细胞复苏方法将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
2.7 单克隆抗体的大量制备大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：一种是杂交瘤细胞体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。
该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。
如果大量生产，费用较高。
另一种方法是最普遍采用小鼠腹腔接种法。
选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。
通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。
该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。
此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
2.8 单克隆抗体的鉴定对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：2.8.1 抗体特异性的鉴定除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。
例如：①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。
②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。
2.8.2 McAb的Ig类与亚类的鉴定一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。
如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。
至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。
在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。