最新单克隆抗体制备方案
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体药物生产工艺流程
单克隆抗体药物生产工艺流程单克隆抗体药物生产那可是个很有趣的事儿呢。
咱先说说细胞构建这一块。
这就像是搭积木的第一步，要找到合适的细胞来生产咱们想要的单克隆抗体。
得从一些特殊的细胞系开始，这些细胞系就像是一个个小小的工厂原料，经过各种基因工程的魔法，把生产抗体的基因给它整合进去。
比如说，把那些能编码特定抗体的基因放进细胞的基因组里，就像给这个小工厂安装上了专门生产某种产品的机器。
这个过程需要特别精细，就像给一个超级精密的手表装零件似的，稍微差一点都不行。
细胞构建好了，就到了细胞培养的阶段啦。
这时候的细胞就像是一个个小婴儿，得给它们提供特别舒服的环境才能茁壮成长。
要有合适的温度，就像我们人感觉最舒服的温度那样，大概是37摄氏度左右呢。
还要有合适的营养物质，这就好比是给小婴儿喂的各种奶粉、辅食之类的。
像葡萄糖、氨基酸这些都是细胞宝宝爱吃的东西。
而且呀，这个环境还得特别干净，一点点污染都不能有，就像咱们住的房子，要是到处是灰尘垃圾，肯定住着不舒服，细胞也是一样的道理。
再说说收获这个环节吧。
等细胞培养到一定的阶段，就像果子成熟了一样，可以收获了。
这时候要把细胞从培养的环境里弄出来，可不能太粗鲁了，得小心翼翼的。
就像摘花一样，要是太用力，花就被弄坏了。
收获后的细胞里就含有咱们想要的单克隆抗体啦。
然后就是纯化的过程。
这就像是从一堆宝藏里把最珍贵的那颗钻石挑出来。
细胞里有各种各样的东西，但是咱们只想要单克隆抗体。
纯化就是用各种高科技的方法，把抗体和其他的杂质分开。
比如说利用抗体和一些特殊物质的亲和力不一样，就像磁铁吸铁一样，把抗体吸附出来，把其他东西留在一边。
最后就是制剂这一步啦。
纯化好的单克隆抗体还不能直接用呢，得把它做成合适的剂型。
就像咱们把面粉做成面包、面条一样。
可以做成注射液之类的剂型，这样就能方便地给病人使用啦。
这个过程也要注意很多细节，像药物的稳定性、无菌性这些都是必须要保证的。
制备单克隆抗体的流程
制备单克隆抗体的流程首先呢，得免疫动物。
就是要给动物注射特定的抗原哦。
这个抗原的选择可重要了呢！我觉得这一步得好好考虑清楚，要根据你想要得到的单克隆抗体的特性来选抗原。
你可别随便就选一个呀！当然啦，不同的动物对不同抗原的反应可能不太一样，这就需要你有点经验或者多做些小试验来确定啦。
接下来，就是取免疫后的动物细胞啦。
一般是取脾脏细胞，这一步要小心点哦！因为脾脏这个器官比较脆弱，要是不小心弄坏了，可能会影响后面的实验呢。
不过也不用太紧张，只要按照基本的操作规范来就好。
然后呢，要把取出来的细胞和骨髓瘤细胞融合。
怎么融合呢？这就用到一些特殊的试剂啦。
这一步呀，我觉得在操作的时候要特别细致。
根据我的经验，融合的条件得控制好，像温度啊、试剂的浓度啊这些，要是稍微有点偏差，可能融合的效果就不太理想了。
融合之后呢，就有了杂交瘤细胞啦。
这时候要进行筛选哦。
为什么要筛选呢？因为我们只想要得到那些成功融合的细胞呀！这一步可不能马虎，要把那些没融合好的细胞或者其他杂质细胞去掉。
这个筛选的方法有好几种呢，你可以根据自己实验室的条件和习惯来选择，我觉得这环节可以根据实际情况自行决定。
筛选出杂交瘤细胞后，就是克隆化培养啦。
这一步很关键呢！要让这些细胞不断地繁殖，得到足够多的细胞。
刚开始可能会觉得这个过程有点漫长，不过习惯了就好了。
在这个过程中，要注意细胞的生长状态，给它们提供合适的生长环境，像营养物质啊、温度啊、湿度这些都得照顾到。
最后呢，就是要检测单克隆抗体啦。
看看你得到的抗体是不是你想要的那种。
这一步要特别注意！小提示：别忘了最后一步哦！要是前面都做对了，最后却没检测好，那可就有点亏啦。
好啦，这就是制备单克隆抗体的大致流程啦。
当然啦，在实际操作过程中，可能会遇到各种各样的小问题，但只要多做几次，积累经验，就会越来越熟练的。
希望大家都能顺利制备出自己想要的单克隆抗体哦！。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备方法
单克隆抗体制备方法
1. 嘿，你知道单克隆抗体制备第一步是啥吗？就好像搭房子得先有稳固的地基呀，这第一步就是免疫动物。
比如给小老鼠打上特定的抗原，让它的免疫系统开始行动起来！
2. 然后呢，就要融合细胞啦！这就像把两种不同的力量汇聚在一起，产生奇妙的反应。
像骨髓瘤细胞和免疫细胞的融合，多神奇呀！
3. 筛选阳性克隆，哇哦，这可是个精细活儿呀！就好像在一堆沙子里找出金子一样不容易呢。
比如说在众多细胞中找出能产生我们需要抗体的那一个。
4. 接下来得克隆化培养啦！这就好似精心呵护一棵小树苗，让它茁壮成长。
把筛选出来的细胞好好培养，让它不断繁殖。
5. 扩大培养也很重要哟！这不就像把一个小团队发展成一个大部队嘛。
让细胞数量大量增加，为后面做准备。
6. 单克隆抗体的收集，哇，终于等到这一刻啦！就像收获辛勤劳作后的果实一般让人开心呀。
把产生的抗体收集起来。
7. 之后还得对抗体进行鉴定呢，这难道不像是给一件宝贝做个全面检查，看看它是不是真的厉害。
比如检测它的特异性啥的。
8. 纯化抗体也是必不可少的步骤呀，这就好比把杂质去掉，只留下最纯净的精华，让抗体更加好用。
9. 最后可别忘记保存抗体哦，要好好地保护起来，让它随时能发挥作用。
就像把宝贝放在一个安全的地方。
我的观点结论：单克隆抗体的制备真的是一个很神奇的过程，每一步都至关重要，需要我们认真对待才能得到好用的单克隆抗体呀！。
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单克隆抗体制备方案单克隆抗体制备方案细胞融合前准备一、动物免疫1.1 动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的纯系Balb/c小白鼠，雌雄皆可，鼠龄8周左右。
为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
1.2免疫原制备15ml离心管15个、50ml离心管7个、10ml注射器5支、Tip头20个、电子天平、CFA、PBS、CFA（使用前需震摇）50μg /只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入7mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
100μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入3mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
150μg/只：称取90mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入2mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
200μg/只：称取80mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
250μg/只：称取100mg乳铁蛋白溶于10mlPBS中，充分混匀。
取1ml加入1mlPBS 中，混匀。
从中取1ml加9mlPBS于50ml离心管中，加10mlCFA于该离心管中。
反复摇晃，用注射器反复推吸。
取一滴加入水中，如果不立即散开，则乳化好。
4℃保存。
1.3 实验步骤初次免疫： 50μg、100μg、150μg、200μg、250μg抗原溶于PBS中，加等体积的福氏完全佐剂（CFA）腹腔和皮下注射。
（共25只小鼠，每组5只，两只采用背部皮下注射，共1ml，0.2ml/点，3只采用腹腔注射）3周后第二次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加福氏不完全佐剂（IFA），腹腔和皮下注射3周后第三次免疫：与初次免疫等量的抗原溶液加等体积加IFA，腹腔和皮下注射，5天后内眦静脉或断尾取血以ELISA间接法测效价2～3周后加强免疫：取初次免疫抗原一半的量溶于PBS，静脉或脾内缓慢注射，以免动物发生过敏性休克而死亡。
3～4天后腹腔注射大鼠、小鼠一般一人即可注射：以左手大拇指与食指执住鼠两耳及头部皮肤，腹部向上，将鼠固定在手掌间，必要时，以左手无名指及小指夹住鼠尾；右手持连有5号针头的注射器，将针头从下腹部朝头方向刺入腹腔，回抽无回血或尿液，表示针头未刺入肝、膀胱等脏器，即可进行注射。
进行腹腔注射时应注意：1、针头刺入部不宜太近上腹部或太深，以免刺破内脏。
2、针头与腹腔的角度不宜太小，否则容易刺入皮下。
3、用的针头不要太粗，以免药液注射后从注射孔流出。
注射后用棉球按一下注射部位。
4、为避免注射后药液从针孔流出，也可在注射时先使针头在皮下向前推一小段距离，然后再刺入腹腔。
皮下注射皮下注射较简单，一般都取背部及后腿皮下。
注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即进行注射。
注射器针头不易进入，硬进容易折断针头，故给这些动物作皮下注射时不应选背部皮肤。
一般狗、猫多在大腿外侧；豚鼠在后大腿内侧或小腹部；大鼠可在侧下腹部。
兔在背部或耳根部注射。
1.4 注意事项①免疫时抗原的剂量应根据其免疫原性制定，若免疫原性较弱，需在50～100μg 基础上增加。
②商品化的福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
抗原溶液的体积不能大于佐剂的体积，否则很难乳化好。
一般首次注射时佐剂和抗原溶液的比例为1:1。
③佐剂加入抗原后一定要充分混合成乳剂，混合的方法有研磨法和注射器混合法。
乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好；如保持完整不散开，呈滴状漂在水面则为乳化完全。
乳化过的物质放置一段时间出现油水分层也表明未乳化好。
④测抗体效价的方法有ELISA间接法、免疫双扩散法、环状实验等。
用双向免疫法测定时效价达到1：16以上可用于融合实验；用ELISA方法测定时效价达到1：16000后可用于融合。
皮下注射给药皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。
作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。
操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。
拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。
二、脾淋巴细胞1. 试剂4%的台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨后，再加蒸馏水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。
使用时需用0.1mol/L的PBS稀释至0.4％（w/v），即1ml 4%的台盼蓝加9ml 0.1mol/L的PBS。
RPMI-1640培养液10%FCS-1640培养液2. 试验步骤①加强免疫3天后摘除眼球放血，收集血清留作抗体检测时的阳性对照。
试管静置30～60min后，将血块轻轻剥离管壁，3000r/min离心15～20min，吸取上清（血清）4℃冰箱保存备用。
②脱椎处死小鼠，浸泡于75％酒精中消毒1min③在超净工作台中用无菌手术剪刀剪开小鼠左侧皮肤，暴露腹膜，打开腹腔，在无菌条件下取出脾脏置于盛有10ml不完全RPMI-1640培养液的平皿中，轻轻洗去脾脏上的红细胞并细心剥去周围结缔组织，于盛有10ml的RPMI-1640培养液的无菌平皿中过不锈钢筛网用注射器针芯研磨脾脏后用玻璃吸管吹打数次制成细胞悬液，移入10ml离心管中。
④沉降大块的结缔组织，把细胞悬液转移到50ml离心管中⑤以RMPI-1640培养液充满50ml离心管，配平后在室温下以1000r/min离心10min，弃上清⑥用约10ml的新鲜RPMI-1640培养液重悬⑦重复⑤⑥步骤⑧计数活细胞：把细胞悬液稀释到约6个/ml，将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
用移液枪取0.9ml细胞悬液和0.1ml浓度0.4％的台盼蓝工作液于EP管中，充分混匀中静置1～2min，不超过5min。
如果染色时间太久，细胞将下沉或受损，而且部分活细胞也会着色。
用加样器小心混匀细胞悬液后，立即用微量加样器将其加于血球计数板，置于倒置显微镜下观察并计数活细胞和死细胞。
死细胞被染成淡蓝色，活细胞排斥台盼兰，不被染色。
活细胞数大于80%为合格。
3. 注意事项①取样计数前应充分混匀细胞悬液。
②数细胞的原则是只计数完整的细胞，镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
若细胞压在格线上时，只计上侧和左方的。
③操作时注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
④一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×108左右。
三、饲养细胞①10～12周龄Balb/c小鼠脱椎处死，浸泡于75％酒精，消毒3min～5min②用注射器抽取5ml预冷的10%的FCS-1640培养液注射到小鼠腹腔（严禁刺破肠管）并用手指轻揉3min～5min后，用无菌剪刀剪开小鼠腹部一小口，用圆头尖吸管吸出并移入50ml离心管中。
吸的过程一定不要刺破肠管以免细菌污染。
③室温1200r/min离心5min～6min④弃上清液，用10%胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105个/ml⑤将细胞转入96孔培养板，每孔100μl，放入37℃CO2培养箱中培养.四、骨髓瘤细胞1.骨髓瘤细胞介绍目前应用最多的是Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14（简称SP2/0）细胞株。
骨髓瘤细胞适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。
细胞的最大密度不得超106个/ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
一般在融合前两周就应该对其进行复苏。
SP2/0细胞为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
在细胞融合的前一天用新鲜的10%FCS-1640培养基调整细胞浓度为2.0×105个/ml，次日取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，于室温1000g（3000r/min）离心10min收集沉淀，以无血清RPMI-1640培养液重悬并计数。
此时细胞形态良好，观察形态完整，排列整齐，密度为0.1×106～1×106个/ml。
经胎盼蓝染色活细胞数>95%。
SP2/0细胞是肿瘤细胞株，一般注射到小鼠体内约1周左右就可以使小鼠致死。
在其状态萎靡的时候就可以用基础培养基洗出其腹腔中的细胞，分离SP2/0细胞。
整个过程要保证无菌，否则就前功尽弃了。
为了防止骨髓瘤细胞（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT缺陷株）变异出现返祖现象，在融合前骨髓瘤细胞株可在含有15μg/ml或20μg/ml的8－氮鸟嘌呤(8-AG)的培养基内适应性培养一周或定期对细胞进行筛选，再转入完全培养基培养1～2周即可用于融合。
8-AG一般试剂公司都有（如Sigma），使用时需仔细看说明，根据根据说明配置相应浓度的8-AG。
2.细胞培养①每月用新洁尔灭或84消毒液擦拭无菌间的所有所有器件、地板和墙壁一次，进行彻底消毒。
②一般在实验前用紫外灯照射无菌室30～60min，实验做完后再用紫外灯照射30min。
配合紫外线灭菌灯使实验室经常保持高度的无菌状态。
紫外灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体分子具有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。
由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十分钟即可进入。
③实验前开启超净工作台内紫外灯，照射10～30min，然后让超净工作台预工作10min～15min，以除去臭氧和使工作台面空间呈净化状态。
④进入无菌培养室原则上应按外科手术进行洗手和着装，即穿戴无菌服、帽子和口罩，并换鞋。
用后要清洗消毒备用。
开始操作前用75%酒精和0.2%新洁尔灭消毒手和前臂，洗手时要洗刷到肘部。
使用过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。
⑤无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。