单克隆抗体制备流程
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
制备过程1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
小鼠单克隆抗体制备流程
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单克隆抗体制备
3. 因操作时间长，宜在4℃操作，预防影响免疫球蛋白 活性。
动物体内后可被不一样B细胞克隆同时识别，经过一定时 间，受刺激B细胞克隆针反抗原表位多少而产生对应特异 性抗体，每一抗原表位都能诱发对应B细胞克隆产生单克 隆抗体，此取得血清即为含各种单克隆抗体混合物，称之 为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。
优质免疫血清产生，主要取决于抗原纯度和免疫原性， 以及动物免疫应答能力。另外，尚需考虑免疫路径、抗原 剂量、注射次数、时间间隔和有没有佐剂等原因。
单克隆抗体制备
兔初始免疫体重通常在2～2.5kg。 第8页
免疫方法
1. 免疫路径 1）注射方法: 静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和 淋巴结等。 2）免疫方法: 小剂量、多点、多路径方法。 3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采取小 鼠腹腔注射。 4）可溶性抗原（如IgG）采取弗氏完全佐剂乳 剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。
单克隆抗体制备
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（4）骨髓瘤细胞准备 复苏骨髓瘤细胞用10％FCS-RPMI-1640培养液培
养1周, 2～3天换液一次, 依细胞生长情况3～4天传 代一次, 适宜密度3×105/ml。融合之前3天, 天天换 二分之一培养液, 使细胞保持在对数生长久。取对数 生长骨髓瘤细胞离心, 用无血清培养液洗2次, 调细 胞浓度为1～2 107 / ml备用。
单克隆抗体制备
第19页
（5）细胞融合 1）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1: 10或1: 5百分比混
合，在50ml离心管中用无血清培养液洗1次，离心 弃上清； 2）1min内加入37℃预温1ml 50％PEG溶液，边加边 摇37℃水浴1min； 3）加37℃预温不完全培养液以终止PEG作用，每隔 2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml； 4）离心，弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液 重悬； 5）将上述细胞加入已经有喂养细胞96孔培养板内， 每孔100 l ，放入37℃ 5％CO2培养箱培养。
杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程
杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程嘿，朋友！你知道吗？这杂交瘤生产单克隆抗体可真是个神奇又厉害的东西！咱先来说说这制备原理。
你就把它想象成一场细胞间的“相亲大会”。
B 淋巴细胞，就像是个敏感又多才多艺的家伙，能产生抗体，但是它命短啊，就像那一闪而过的流星。
而骨髓瘤细胞呢，就像个长生不老的“老妖”，能不停地分裂繁殖，可就是没那产生抗体的本事。
那怎么办？咱就让它们俩凑一块儿呗！这一凑，就好比牛郎织女相会，产生了杂交瘤细胞。
这杂交瘤细胞可不得了，既有 B 淋巴细胞产生抗体的能力，又有骨髓瘤细胞长生不老、不停分裂的本领。
这不就完美了吗？再来说说这技术流程，那也是步步精心啊！首先得准备好“原料”，把 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞养得壮壮的。
这就好比要做出美味的饭菜，得先有新鲜的食材不是？然后呢，让它们融合。
这融合的过程就像是搭积木，得小心翼翼，找准位置，才能搭得牢固。
融合之后，就得像选秀一样，把那些优秀的杂交瘤细胞选出来。
这可不容易，得经过一轮又一轮的筛选。
选出来之后，还得让它们大量繁殖。
这就像是种庄稼，得给足阳光、水分和肥料，才能有个好收成。
繁殖多了，还得提纯抗体。
这提纯的过程，就像是从一堆沙子里淘出金子，得有耐心，有技巧。
你说，这过程是不是既复杂又有趣？朋友，你想想，要是没有这杂交瘤生产单克隆抗体的技术，咱们在医学上得走多少弯路啊！很多疑难杂症可能就没法攻克，很多人的生命可能就没法挽救。
所以说，这杂交瘤生产单克隆抗体的技术，那就是医学领域的一把利剑，为我们披荆斩棘，带来希望！。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程介绍在免疫学领域，单克隆抗体制备是一项重要的研究工作。
通过制备单克隆抗体，可以获得对特定抗原高度特异性的抗体，具有广泛的应用价值。
本文将详细介绍单克隆抗体的制备流程。
单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体的制备基于B细胞免疫学的原理。
B细胞是免疫系统中的一类淋巴细胞，具有抗体分泌的能力。
当机体暴露于外来抗原后，B细胞会被激活，并分化为两种类型的细胞：浆细胞和记忆B细胞。
浆细胞能够产生大量的抗体，但其分泌的抗体种类较为杂乱，无法特异性地与目标抗原结合。
而记忆B细胞则保存了对特定抗原的记忆，并可以长期存活。
单克隆抗体的制备即是利用记忆B细胞的特性，将其从免疫动物中分离出来，并通过细胞融合等技术手段获得对特定抗原高度特异的抗体克隆株。
单克隆抗体制备流程1. 免疫动物的免疫与抗原刺激•选择适当的免疫动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
•将免疫动物注射所需抗原，通常包括纯化的蛋白质或抗原表位含有的多肽片段。
•观察免疫动物的免疫反应，收集其血样。
2. 浆细胞的分离与筛选•从免疫动物的血样中分离出含有浆细胞的细胞组分。
•利用细胞表面特定抗原分子，如CD138等，通过细胞分选技术选择性地富集浆细胞。
3. B细胞的分离与筛选•从免疫动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞。
•利用B细胞特异的抗原表面标记物，如CD19等，进行细胞分选，选择性地获取B细胞群体。
4. B细胞与浆细胞的细胞融合•将B细胞和浆细胞以特定比例混合。
•利用细胞融合剂（如聚乙二醇）促使B细胞与浆细胞融合，形成受体细胞。
5. 杂交瘤细胞的筛选与生长•将融合后的受体细胞接种在富含肿瘤细胞的培养基中。
•利用培养基中肿瘤细胞的恶性增殖特性，筛选出杂交瘤细胞。
•杂交瘤细胞具有稳定的细胞倍体数和持久的增殖能力，适合大规模抗体的制备。
6. 单克隆抗体的筛选与鉴定•将杂交瘤细胞进行分离和延养，获得单个克隆细胞系。
•通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组化等方法筛选出对目标抗原高度特异的单克隆细胞系。
制备单克隆抗体的流程
制备单克隆抗体的流程首先呢，得免疫动物。
就是要给动物注射特定的抗原哦。
这个抗原的选择可重要了呢！我觉得这一步得好好考虑清楚，要根据你想要得到的单克隆抗体的特性来选抗原。
你可别随便就选一个呀！当然啦，不同的动物对不同抗原的反应可能不太一样，这就需要你有点经验或者多做些小试验来确定啦。
接下来，就是取免疫后的动物细胞啦。
一般是取脾脏细胞，这一步要小心点哦！因为脾脏这个器官比较脆弱，要是不小心弄坏了，可能会影响后面的实验呢。
不过也不用太紧张，只要按照基本的操作规范来就好。
然后呢，要把取出来的细胞和骨髓瘤细胞融合。
怎么融合呢？这就用到一些特殊的试剂啦。
这一步呀，我觉得在操作的时候要特别细致。
根据我的经验，融合的条件得控制好，像温度啊、试剂的浓度啊这些，要是稍微有点偏差，可能融合的效果就不太理想了。
融合之后呢，就有了杂交瘤细胞啦。
这时候要进行筛选哦。
为什么要筛选呢？因为我们只想要得到那些成功融合的细胞呀！这一步可不能马虎，要把那些没融合好的细胞或者其他杂质细胞去掉。
这个筛选的方法有好几种呢，你可以根据自己实验室的条件和习惯来选择，我觉得这环节可以根据实际情况自行决定。
筛选出杂交瘤细胞后，就是克隆化培养啦。
这一步很关键呢！要让这些细胞不断地繁殖，得到足够多的细胞。
刚开始可能会觉得这个过程有点漫长，不过习惯了就好了。
在这个过程中，要注意细胞的生长状态，给它们提供合适的生长环境，像营养物质啊、温度啊、湿度这些都得照顾到。
最后呢，就是要检测单克隆抗体啦。
看看你得到的抗体是不是你想要的那种。
这一步要特别注意！小提示：别忘了最后一步哦！要是前面都做对了，最后却没检测好，那可就有点亏啦。
好啦，这就是制备单克隆抗体的大致流程啦。
当然啦，在实际操作过程中，可能会遇到各种各样的小问题，但只要多做几次，积累经验，就会越来越熟练的。
希望大家都能顺利制备出自己想要的单克隆抗体哦！。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
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单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓ 2～3周后 第二次免疫 1×10７／0.5ml ip ↓ 3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射 │ (一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │ (ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
(二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入6～8ml培养液 ↓ 反复冲洗，吸出冲洗液 ↓ 放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟 ↓ 用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml
↓ 加入96孔板，100μl／孔 ↓ 放入37℃ CO2孵箱培养 一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。
(三) 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。
(四) 免疫脾细胞 免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤 (一) 细胞融合流程 (1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 (3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。 (5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。 (6) 在室温下融合: ① 30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。
② 作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。 ③ 加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
(7) 离心，800rpm，6分钟。 (8) 弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9) 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。 (10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
一般一块96孔板含有1×107脾细胞。 (二) HAT选择杂交瘤 应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。
一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。
50×HAT H: 5×10-3M A: 2×10-5M T: 8×10-4M 一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
三、抗体的检测 筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有: 1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。 2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。 3. FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。 4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。 上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。 可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。 四、杂交瘤的克隆化和冻存 克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
(一) 克隆化方案 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。 1. 有限稀释法的程序 ① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备) ② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml ③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
④ 培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。