单克隆抗体制备的技术
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Koehler和Milstein在体细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤（hybri-doma)技术，他们将丧失合成次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞举行融合，融合的细胞不仅可以延续传代，而且能分泌抗绵羊红细胞的单克隆抗体，这项技术开创了医学与生物学基础讨论的新纪元。
杂交瘤技术具有周期长，高度延续的特点，涉及大量组织细胞培养，细胞免疫学和免疫化学等办法。
一、杂交瘤技术的原理 B淋巴细胞接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，是重要的体液免疫细胞。
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再举行细胞分裂。
骨髓瘤细胞是恶性增殖的转化细胞，通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。
B淋巴细胞杂交瘤技术的原理可以从以下三个关键之处来阐明：首先是细胞融合剂的挑选，用法细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于互相粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，普通应用浓度为40% (W/V)。
第二，细胞融合的挑选培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶吟( aminopterin, A）和(thymidine, T )，所以取三者的字头称为HAT培养基。
甲氨蝶吟是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。
惟独融合细胞具有亲代双方的遗传性能，能在HAT培养基中长久存活与繁殖。
第三，细胞融合是随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。
筛选过程普通分为两步举行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上举行的特异性抗体筛选，从而找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后举行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养，这一过程称作克隆化。
单克隆抗体技术（文献综述）
文献综述—单克隆抗体技术的原理、发展与主要的实验步骤1. 单克隆抗体制备的基本原理经免疫的动物产生的致敏B淋巴细胞能分泌特异性的抗体，但这些细胞不能在体外长期存活；而骨髓瘤细胞则可以在体外大量地、无限地繁殖，但不能分泌特异性的抗体。
如果应用杂交瘤技术使骨髓瘤细胞与那些能分泌特异性抗体的细胞相融合，那么得到的杂交瘤细胞（hybridoma cell）将同时具有两种亲本细胞的特性：既能够象肿瘤细胞那样无限繁殖，又具有B淋巴细胞的不断分泌抗体的能力。
根据克隆选择学说，由于每个致敏的B淋巴细胞只能针对同一抗原决定簇产生同种的、完全一样的抗体，所以经过克隆化的杂交瘤细胞就能够分泌对某一抗原决定簇具有特异性的单克隆抗体。
这就是单克隆抗体制备的基本原理。
2. 单克隆抗体技术的诞生、发展和展望1975年，George Kohler 和 Cesar Milstein在Nature上发表了一篇文章，第一次描述了一种获得单克隆抗体的方法。
他们所创立单克隆抗体技术给免疫学乃至整个生物医学领域带来了一次巨大的革命。
Kohler 和Milstein 也因此而荣获1984年诺贝尔奖。
单克隆抗体技术诞生后，立即引起了许多研究者的注意，人们纷纷投入这一崭新领域的研究。
经过多年的发展，到二十世纪八十年代中期，单克隆抗体技术已日臻完善，单克隆抗体也开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
最初，单克隆抗体技术是以小鼠－小鼠杂交瘤为研究的中心而发展起来的。
由于小鼠源性的单克隆抗体在生产与应用中有其内在的缺点，八十年代后，小鼠－大鼠、大鼠－大鼠、小鼠－人以及人－人杂交瘤技术也被尝试并取得了不同程度的成功,有力地推动了单克隆抗体技术的发展和生物医学研究的深入。
尽管早有准备,单克隆抗体技术的影响之深远还是大大超出了人们的预想：在八十年代中到九十年代末的短短十多年中，为了满足临床诊断和治疗的需要，双特异性抗体技术及人－鼠嵌合抗体技术、人源化抗体技术、小分子抗体技术、植物基因工程抗体技术、抗体酶技术、抗体库(噬菌体显示）技术、外因鼠(XenoMouse)技术等基因工程抗体技术在经典单克隆抗体技术的基础上也被创立并得到了突飞猛进的发展。
单克隆抗体研制最详细步骤
单克隆抗体研制最详细步骤一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理介绍在生物医学研究和临床诊断中，单克隆抗体作为一种重要的实验工具和治疗药物被广泛应用。
其中，利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力的特点，成为研究人员的首选。
本文将介绍利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理。
杂交瘤技术概述杂交瘤技术是一种将体外培养的B细胞（淋巴细胞瘤）与骨髓瘤细胞融合，从而形成能够长期生长并分泌抗体的细胞株的方法。
这种技术利用了淋巴细胞瘤的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限生长能力，使得细胞株能够持续产生具有特定结构和功能的单克隆抗体。
杂交瘤技术的步骤利用杂交瘤技术制备单克隆抗体一般包括以下几个步骤：1. 免疫原注射首先，在动物体内注射免疫原，激发机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂质等。
免疫原的选择要根据研究目的和所需抗体的特异性来确定。
2. B细胞提取从动物体内采集淋巴组织，提取出具有特异性抗体的B细胞。
B细胞是产生抗体的主要细胞类型，其具有表面上能与抗原结合的B细胞受体（BCR）。
3. 骨髓瘤细胞准备获得与B细胞体表BCR相对应的骨髓瘤细胞株。
骨髓瘤是一种恶性浆细胞增生性疾病，该病的细胞具有无限生长的能力。
4. 细胞融合将提取的B细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的过程一般利用聚乙二醇（PEG）或电脉冲等方法实现。
5. 杂交瘤细胞筛选将杂交瘤细胞进行培养，并添加合适的选择性培养基，筛选出能够分泌特异性抗体的单个细胞克隆。
6. 单克隆抗体制备从筛选出的单个细胞克隆中，取出细胞进行进一步培养和扩增。
细胞培养过程中，单克隆细胞会不断分裂和分泌抗体，从而得到大量的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的原理利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理主要基于两个关键特性：1. B细胞多样性B细胞具有多样的B细胞受体，这使得它们能够识别和结合各种不同的抗原。
当机体暴露于免疫原时，B细胞会通过BCR与特异性抗原结合，并启动免疫反应。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体来源：1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单抗制备
杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。
下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程首先，在单克隆抗体制备之前，需要选择一个适当的抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。
选取抗原时，需要考虑抗原的表达水平、抗原的免疫原性以及抗原的稳定性等因素。
接下来，选择一个合适的实验动物进行免疫。
常用的实验动物有兔子和小鼠。
在免疫之前，需要先给实验动物注射适量的佐剂，以增强免疫效果。
通常，实验动物会被多次免疫，每次免疫之间有一段时间的间隔。
在实验动物免疫一段时间后，可以进行细胞融合以产生混杂瘤细胞。
混杂瘤细胞通常是由B细胞和骨髓瘤细胞融合而成，对于小鼠骨髓瘤细胞，常用的有SP2/0和NS0细胞系。
融合的方法主要有两种：一种是将免疫细胞和骨髓瘤细胞混合，然后使用聚乙二醇（PEG）进行融合；另一种是使用电击脉冲进行细胞融合。
融合细胞会经过适当的培养条件进行筛选和扩增。
在融合细胞扩增过程中，会进行筛选以保证融合细胞是产生单克隆抗体的。
最常用的筛选方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）。
抗原会被固定在微孔板上，然后将培养液中的细胞涂覆在孔中。
如果其中一孔中有抗体分泌，则抗原会被结合，并且可以通过添加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和基质来检测抗体的存在。
经过筛选和鉴定后，选择一个或多个产生单克隆抗体的细胞进行单克隆扩增。
单克隆扩增时，可以通过细胞有限稀释法以及酵母酶聚合酶链式反应（YAC-PCR）等方法进行。
最后，可以通过收集上述单克隆细胞的上清液或细胞提取物来得到单克隆抗体。
上清液或细胞提取物中的抗体可以通过纯化方法，如蛋白A/G 亲和层析或蛋白L亲和层析等，得到纯化的单克隆抗体。
综上所述，单克隆抗体的制备流程包括抗原选择、免疫动物、细胞融合、筛选和克隆等步骤。
通过这些步骤，可以获得单克隆抗体用于科学研究和临床应用。
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免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提 供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血 清中抗体效价不一定最高。
可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完 全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫 （量减半，改用不完全佐剂，可反复多 次)冲击免疫（融合前3天进行）
抗体的人源化技术进展:
• 单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。 • 单抗将发展成为一大类独立医药产品。 • 鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代: 原因：1.鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，
2.CDC作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱； 3.与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱； 4.鼠源抗体半衰期短，发挥ADCC与CDC作用的时间较短； 5.鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。
鼠抗体人源化的构建方法:
嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体
恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度 达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性 ，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了30%的鼠源性，可诱发人抗 小鼠反应HAMA。
表面重塑抗体：对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅
替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选 用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换:互补决定区（CDR）构象的残基尽量不 替换。
重构抗体：由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包
括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区（SDR）转移。
转染色体牛:
产生人Ig 转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法，将构建的含有人Ig 轻重链基因片段的人人工染色体(HAC)，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步 发育成转染色体牛。
产生人Ig 转染色体牛的构建特点在于：
(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系， 因此将人人工染色体导入牛胚胎成 纤维细胞；
(2)转染色体牛用核移植的方法来建立；
抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达 抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针 对任何抗原的单克隆抗体。
单克隆抗体药物概况
单克隆抗体（MAB）是近年来复合年增长率最大的
一蛋白类药物，2001年全球销售额增长了57.3%，接 近30亿美元。在这类产品中开发主要集中在癌症治疗 药物方面。预计到2010年用于癌症治疗的单克隆抗体 将占其销售总额的54.7%。据预测，单克隆抗体将会 以复合年增长率16.3%的速度增长，到2010年达到 121.39亿美元的市场规模。其中，治疗癌症的单克隆 抗体市场规模将达66.36亿美元。
单克隆抗体制备平台建立
尹芝南 美国耶鲁大学医学院副教授 南开大学生命科学学院院长
基本概念
抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体
Antigenic determinant
是指抗原分子中决定抗原特异性的 特殊化学基团，又称表位(epitope).
细胞克隆： 由一个细胞增殖而成的细胞集团
全人源化抗体
完全人抗体的形成始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库 筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。
2.1 抗体库筛选技术:
抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。
噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基
因；PCR 扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、V基因Ⅲ(g3) 或基因Ⅷ(g8) 的先导系列的紧靠下游，使 外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp Ⅲ或gp Ⅷ的N 端。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、 简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。
转基因小鼠：将人抗体生产基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体生成基
因。转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人体蛋白单 抗技术。不足之处：(1)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导 致不十分完全的人序列；(2)由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单 抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；(3)转基因小鼠 表达的人Ig多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类。
克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显 微克隆法
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、 变异及污染
单抗生产的方法：
动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸 或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞， 7-10天后出现腹水，无菌采集。
单抗纯化方法：
盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法
基因工程小鼠制备全人抗体
全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠 （hu-PBL-SCID小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。
Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周 血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)，经抗原免疫后可获得人 源抗体。
Ab4
Ab3
Ab2
普通抗血清（多克隆抗体） Ab4
骨髓瘤小鼠
脾
取腹水
B 细
骨髓瘤细胞
胞
+ PEG, 融合
杂交瘤细胞
HAT培养， 稀释
Ab1
单克隆A抗b3体 Ab4
杂交瘤技术的理论基础
淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体
细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性
转染色体小鼠：通过微细胞介导法（MMCT方法）将人14号染 色体上产生IgH 的胚系片段和2号染色体上5～50 Mb 的κ轻 链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后， 可产生抗人血清白蛋白的人Ig，再次免疫后IgM产生。由转染 色体技术得到的小鼠，表达的人IgG各亚类的量与人血清中表 达的IgG各亚类类同，且可同时在一个转基因小鼠内表达；但 是，转染色体小鼠导入的人Ig 片断虽然比较大，但其表达的 人Ig量却比较低。
单克隆抗体特性
理化性状高度均一，生物活性专一，只 与一种抗原表位发生反应，特异性强， 纯度高，易于实验标准化和大量制备
单克隆抗体在医学中的应用
检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代，含有人HAC 的微细胞与牛胚 胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d，因此必须经过2 次筛选，确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多 抗，可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一 定程度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。
Thanks
Thanks for attention
Dec.5.2007
摄于新疆喀纳斯湖2005.8.18
骨髓瘤细胞系选择要点：
稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、 HGPRT缺陷株
常用骨髓瘤细胞系：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）
防止支原体污染（胎牛血清）
融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好 的形态，活细胞计数高于95％
融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环 节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、 克隆化和扩大培养过程中
脾
抗原免疫的脾细胞(B细胞) 小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤)
1.抗体分秘(IgG+)
1.具永生性
2.HGPRT+在HAT生长
2. 8AG筛选出HGPTP-株
PEG 融合 HAT筛选
脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）
（HGPRT+、Ig+）
融合的结果及命运
未融合的骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞
饲养细胞一般在融合前一天制备
免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴 母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强 免疫3天后的脾脏。
融合比例：
骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10
融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）
融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液2周后,改用一般培养液
基因工程抗体与抗体库技术
单抗体内应用和疗效受限原因： 1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量
甚少 3.生产成本高,难于普及应用
人杂交瘤技术未获真正突破原因:
融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不 能随意免疫
基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良 的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的 鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。
Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体
Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞 克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源 抗体
单 克 隆 抗 体 和 多 克 隆 抗 体 产 生 区 别Ab1 Ab3
抗血清
选用6-12周龄Balb/c小鼠
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很 好的免疫效果
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。