蔗糖酶提取方法的研究
蔗糖酶的提取和固化
唐志远 08化生一班 0808106020
蔗糖酶的提取和固化
一：试实验目的
1， 了解酶的提取和初纯化法，掌握高速冷冻离心机的操作技术。
2， 了解固定化酶的原理和优缺点。
掌握制备固定化酶的最基本方法。
二：实验原理
酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶系胞内酶，提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶剂提取，得到的材料称为细胞抽取液。
材料不同破壁的方法不同。
我们用的菌体细胞破壁法是自溶法。
固定化酶是用物理或化学的方法使酶固定。
包括吸附法，包埋法，共价交联法等 三：试剂和器材 略。
四：实验步骤：
1， 蔗糖酶的提取 包括初提取A 液，细提取B 液。
2， 酶的固定化，主要用的是包埋法和共价交联法。
3， 固定化酶活力的测定。
（1） 制作葡萄糖的标准曲线。
（2） 酶活测定。
（3） 计算固定化酶的活力单位。
五：实验数据处理
葡萄糖标准曲线
-0.200.20.40.6
0.8葡萄糖的浓度 mg/ml
吸光度
2，酶活性的侧定
六：实验总结
本次试验主要是酶也得提取，其中在提取的过程中掌握如何使用离心机和注意事项，还有提取液的初提取和精细提取的方法。
酶的固化中让我们了解了几种常用的酶固化的原理，以及操作方法和注意事项。
最后是酶活性的测定基本上是测其吸光度，然后根据吸光度进行计算，并得出结论。
酵母蔗糖酶提取方法的研究
酵母蔗糖酶提取方法的研究生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022指导老师：陶芳摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。
关键词：蔗糖酶提取自溶法Research on the Extraction Method of Yeast SucroseSchool of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2,li Qian, 10197022Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio oflive,recovery and purification.Key words:yeast；extraction；autolysis method前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。
按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。
前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。
蔗糖酶的提取分离
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。
结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。
关键词：蔗糖酶、酶学性质1前言蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。
可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。
本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。
2材料与方法2.1 材料与设备2.1.1 实验材料酵母、活性干酵母、壳聚糖2.1.2 试剂及配制方法葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、NaOH、Na2CO3、盐酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。
95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。
冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。
10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液1%戊二醛溶液：将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL 0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠，溶解于800ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至1000mL。
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
蔗糖酶制备与生化特征及应用研究进展
蔗糖酶制备与生化特征及应用研究进展刁云春1滕丕合1麻婷婷1潘世永1米运宏1，2*（1广西弘山堂生物科技有限公司，广西南宁530031；2南宁纵联科技有限公司，广西南宁，530033）摘要蔗糖酶具有水解酶和转移酶的双重性质，主要用于催化水解蔗糖链中的糖苷键。
本文介绍了蔗糖酶的来源和分类，以酸性酶和碱性酶为代表，分别阐述了两种酶的结构和催化水解蔗糖的机理，并综述了蔗糖酶在工业上的应用，为进一步拓宽蔗糖酶在食品工业中的应用范围提供参考。
关键词蔗糖酶；食品工业；催化机理中图分类号TS201.2文献标识码A文章编号1007-7731（2023）23-24-0146-05蔗糖是使用较为广泛的糖类，其甜味纯正，无不良口感，作为天然甜味剂被广泛应用在食品、医药等领域。
甘蔗和甜菜是制备蔗糖的主要原料[1]。
人体不能直接吸收蔗糖和多糖等物质，须在体内水解转化为单糖（如葡萄糖、果糖等）才能被充分吸收利用。
因此，研究蔗糖的水解有利于甘蔗等糖料资源的充分利用。
蔗糖酶是催化蔗糖水解成果糖和葡萄糖的一种酶，目前与蔗糖酶相关的文献报道较多。
米运宏等[2]利用蔗糖酶制备出高果糖浆；梁鹏等[3]介绍了蔗糖酶、蔗糖异构酶和β-果糖基转移酶等多种延伸蔗糖产业链的相关酶；刘丽娜等[4]对微生物葡聚糖蔗糖酶进行了详细论述，该酶有助于提升通过蔗糖合成葡聚糖和功能性低聚糖的产量。
国外对于不同来源、不同类型蔗糖酶的报道也较多，Manoochehri 等[5]统计出来源于动植物、真菌和细菌等在内的50多种蔗糖酶，其本质属于糖苷水解酶，主要功能是催化蔗糖水解得到葡萄糖和果糖[6]，以及两者等比例混合的转化糖浆，该反应也可通过酸水解发生。
GF ¾®¾¾¾¾¾蔗糖酶G +F 或GF ¾®¾酸G +F 式中，GF 代表蔗糖，G 代表葡萄糖，F 代表果糖。
其中，酸水解通过在高温高压下加入酸性物质使蔗糖水解为葡萄糖和果糖，此方法工序复杂、副产物多且效率低，限制了其在工业上的应用[7]。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。
比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。
纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。
以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。
结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。
可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。
通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。
1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。
1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。
蔗糖酶的提取过程的原理
蔗糖酶的提取过程的原理蔗糖酶是一种重要的酶类物质，其作用是分解蔗糖，将其转化为葡萄糖和果糖等单糖。
蔗糖酶现已被广泛应用于工业和食品加工等领域，因此对于蔗糖酶的提取过程和原理的研究十分重要。
蔗糖酶的提取原理：蔗糖酶主要是存在于细胞内的酶类物质，在提取过程中需要破碎细胞壁、细胞膜等障碍物，使酶类物质释放出来。
因此，蔗糖酶的提取过程可步骤分为细胞破碎、酶的提取、分离纯化等环节。
细胞破碎细胞破碎是蔗糖酶提取的第一步，其目的是将细胞壁、细胞膜等保护层破碎，以便获得高含量的酶液。
细胞破碎主要有三种方法：物理方法、生物方法、化学方法。
物理方法：包括高压破碎法、超声波破碎法、微波破碎法等技术，其中高压破碎法是最为常用的破碎方法，可通过高压融合，将含有酶的细胞破裂。
生物方法：是利用生物体内酶的辅助作用，通过胰蛋白酶等酶的介入，使细胞膜被破坏，从而释放出酶来。
化学方法：通过化学物质对生物组织进行不同程度的破坏，使细胞膜等基本单位出现裂缝，酶液就可以自由地流出。
酶的提取酶的提取是蔗糖酶提取过程的第二步，其目的是从破碎的细胞内提取蔗糖酶。
酶的提取常用的方法有：水解法、溶剂法、膜过滤法等技术。
水解法：是指通过水解反应从生物物质中分离有用成分的方法。
例如，将蔗糖酶浸泡在50温水中，持续2小时左右，使蔗糖酶转化成有利于提取的热变性酶。
溶剂法：即将蔗糖酶和溶剂混合，应用分离纯化技术获得有用的酶液。
溶剂法有界面法、反相分配法、油相萃取法、溶液萃取法等。
膜过滤法：是利用一定的压力，将蔗糖酶溶液通过一定孔径大小的膜片，将酶体分离纯化出来。
分离纯化分离和纯化是蔗糖酶提取过程中的最后一步，其目的是获得高纯度和高活性的酶液。
常用的分离和纯化技术有：离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和色谱法等。
其，默认是将酶液溶液经某些方法处理后，将酶从其他的杂质中过滤出来，其中离子交换层析法是最为常用的手段。
在这种方法下，蔗糖酶分子通过吸附原理与活性生物载体进行相互作用，去除杂质，实现酶活性的提高和纯度的提高。
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朱静， 严 自 正3微 生 物 产 生 的 木 聚 糖 酶 的 功 能 和 应 用 ， 生物 工程学报， ： !884 ， !% （ +） &6)*&69 科学出版社， 6 苏拔贤3生物化学制备技术3北京： !894， !3&"*&4
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加热去除杂蛋白
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： 化学杂志， !88" ， 4（ %） !"%*!"4 生物化学与生物物理学报， ： !88" ， %% （ &） %98*%8% 学性质 3 生物化学杂志， ： !88& ， 8（ 4） 4)8*44&
渐下降， 包含酶和杂蛋白的沉淀量也增加。从收率方 面来考虑， 上清液的活力越高， 收率越高， 因此要求 温度尽可能低一些。而在一定条件下， 沉淀越多， 酶 液越纯， 从这方面考虑温度高一些好。再依据表 % 中 温度对酶失活变性的影响，蔗糖酶在 )", 时要明显 比 +), 时 失 活 严 重 ； 表 & 说明， 在 )", 时 ， 蔗糖酶大 量沉淀， 使酶液活性降低。 所以选取 +), 作为热提温 度较为适宜。
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醇提
按表 ! 所示配比表，分别采用 &"5 、
乙醇提取后沉淀重量
沉淀蔗糖酶。离心 +"5 、 )"5 、 4"5 、 6"5 浓度的乙醇， 后取管中的上清液测定其活性，并用精确电子天平 称取沉淀量。 表! 乙醇浓度配比表 混合液乙醇体积百分比（ 5） 酶液体积（ #$ ） 乙醇体积（ #$ ）
% 材料与方法
%#% 材料与仪器
收稿日期： #$$%*%#*%. 作者简介：孙国志（ ， 男， 助教， 研究方向： 生化工程及天然产 &()*+ ） 物的研究与开发。
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孙国志 冯惠勇
摘 要 介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的方法。通过试验确定了 用冰融研磨法提取蔗糖酶的最佳条件，即通过反复冰冻 研磨破碎细胞、 !"# 水 浴 加 热 提 取 并 去 除 杂 蛋 白 、 "$% 乙 醇沉淀，在保持较高酶活力和收率的情况下制得成品蔗 糖酶。 蔗糖酶 提取
中图分类号： !"#$%&#’( 文献标识码： ) 文 章 编 号 ： %$$#*$+$, （ #$$# ） $-*$$(-*$#
!O7*%,O 型冷冻离心机。 # 型电热磁力搅拌器，
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蔗糖酶酶活的测定方法
采用 =J" 显色方法， 通过测定样品中还原糖的
量， 确定蔗糖酶酶活 ?LA。
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葡萄糖浓度标准曲线
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工艺技术
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蔗 糖 酶 提 取 方 法 的 研 究
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（ 河北科技大学生物工程学院， 石家庄 $"$$&’）
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工艺技术
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表% 样品管 空白 对比 不同温度除杂蛋白后上清液活性测定 热提温度（ ,） 吸光度 <
样品二： 把 甲 苯 改 为 !"#$ 脱 离 子 水 ， 再按与上 面的方法相同的步骤实验， 并且研磨相同的时间。 它的研磨方法 样品三： 只 加 入 %"#$ 脱 离 子 水 ， 就 在 冰 箱 中 冰 冻 约 !"#’( （ 研磨液 是 每 研 磨 &"#’( ， 面上刚出现冻结为宜） ， 重复以上两个步骤， 直到达 到相同的时间， 并加入 %%#$ 脱离子水。 取沉淀研磨液上清液倒入小烧杯中， 洗 涤 沉 淀 两次， 把洗涤上清液倒入小烧杯中， 分别把三个上清 用冷冻离心机 在 液定容至相同体积， 取 )#$ 上清液， 温度 "*+, ， 转速 !%"""- . #’( 条件下离心 !)#’( 。吸 取上清液， 用 !#/$ . 0 醋酸分别调 12 至 )3" 。
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蒸馏水配置成一定梯度浓度的溶液，与 =J" 显色后 在 (-$9> 测定吸光值。以吸光度 ) 对葡萄糖浓度作 标准曲线， 如图 % 所示。
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蔗糖酶酶活力计算公式 吸光度 )S%$$$S 稀释倍数 活力单位（ —— —— —— —— —QL-&%%S 吸光度 )S 稀释倍数 T U >I） Q——
67 +&#&%&#,G 和从葡萄糖末端切开蔗糖的 "*=*葡萄糖
苷酶（ 。前者存在于酵母 "*=*HI/0D3EF23435 67 +&#&%&#$） 中， 后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取 。
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人造蜂蜜， 防止高浓度糖浆中的蔗糖析出， 还用来制 造含果糖和巧克力的软心糖等。 本实验目的在于用冰融法在不同的 条 件 下 提 取 酵母中的蔗糖酶， 比较其酶活力， 以确定最佳的提取 条件 ?(5,A。
不大，但二号样品由于甲苯的存在给离心后上清液 的收集带来了不便， 并且如果去除不净， 会对后续工 作产生影响。三号样品效果较好， 其原因一是在冷冻 过程中会促使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加 细胞的亲水性能； 二是反复冷冻使细胞内形成冰晶， 引起细胞膨胀而破裂。另外由于每 隔 &"#’( 冰 冻 一 次， 整个提取过程保持较低温度， 酶失活率较低。
表+ 乙醇浓度（ 5） 吸光度 < 表) 乙醇浓度（ 5） 沉淀重量（ L） 乙醇提取后上清液酶活
在 水 浴 中 迅 速 加 热 到 +", 后 ， 缓 慢 搅 拌 &"#’( ， 取出 置于冰浴中迅速冷却。然后在冷冻离心机中， "*+, ， 取上清液测酶活。在 +) 、 !)"""- . #’( 离心 !)#’( ， )" 、 以待比较。 )) 、 4", 四个水浴温度下重复以上步骤，