石蜡切片具体过程及操作步骤精心整理
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石蜡切片具体过程及操作步骤
固定:
组织块大小:1.5×1.5×0.2 CM
固定液>4倍组织体积
福尔马林固定
市售为40%甲醛水溶液,应放入小量碳酸钠放置一段时间
福尔马林固定液:40%甲醛溶液1份,水9份
固定数小时后用水洗24小时
优点:克服了乙醇固定的缺点
脱水(组织块)
70%乙醇片刻
80%乙醇2-4小时
95%乙醇2-4小时
95%乙醇2-4小时
100%乙醇2-4小时
100%乙醇2-4小时
注:为保证100%乙醇无水,可在容器中放入无水硫酸铜吸收水分,变蓝后更换。
最好能将100%乙醇中取出来的组织浸入香柏油后再经二甲苯后浸石蜡。
透明(组织块)
100%乙醇:二甲苯(1:1)15分钟
二甲苯15分钟
二甲苯15分钟
注意:时间太长变脆
浸蜡(组织块)
石蜡熔点52—56℃
温箱:56℃
二甲苯:石蜡(1:1)1-2小时
石蜡1-2小时
石蜡1-2小时
包埋
将熔化了的石蜡倾入包埋框内,随即迅速将组织块用加温了的镊子送置于框内,平置底面。注意组织切面,放入冷水,冷固后将蜡块修齐,固定于木块上。
石蜡切片
切片机:调整好。
刀:磨刀时一个方向,液体石蜡。
切下的片子,右手用弯镊子轻轻钳牢石蜡切片,左手用干燥毛笔将切片取下,放入盛温水(约
30℃)的玻璃皿内,将切片摊于温水面上,光亮的切面向下,用弯镊子细心张开皱纹。然后将水温加到40℃,使切片更平均地展开于水面上,再用弯镊子细心分开各蜡片,将涂过少许蛋白甘油的载玻片沉至切片下面,然后将切片从水面取出。最后将切片置于56℃保温箱内烘干,需时2小时。
刀的倾角:20—30°
冬天石蜡52-54℃,夏天56-58℃
HE染色法
石蜡切片
Ⅰ二甲苯2-5分钟(冬季56℃温箱)
Ⅱ二甲苯2-5分钟(冬季56℃温箱)
100%乙醇1min
95%乙醇1min
80%乙醇1min
70%乙醇1min
先用自来水而后用蒸馏水洗0.5min
Harris氏苏木紫液5min。苏木紫为盐基性染料可染细胞核。在冬季可预先放入保温箱内,使染剂保持在30℃左右,如此染5min即已足够。染色时间与气候和染液的浓度都有密切关系,须灵活掌握。
自来水洗2秒钟。
用1%酸性酒精(1mLHCl和99mL70%酒精混合液)分化5秒钟。
用自来水洗少许时候,而后入饱和碳酸锂水溶液中,使切片变蓝色,共需时约10秒钟。(此步后须用镜检细胞核是否适当,如细胞核过淡,可用自来水和蒸馏水洗一下,再用苏木紫重染,如细胞核过深,可用水洗一下,再在酸酒精中分化一下,其余步骤与上相同。此步骤镜检很重要,不可忽视。)
充分流动自来水冲洗2-10min,冲洗时间愈久,分化愈清楚(但不要超过12小时)。而后入80%酒精中1分钟。
入0.5%伊红酒精溶液中1-2min(伊红为酸性染色剂,可染细胞浆,100mL溶液中加入1-2滴冰醋酸,冰醋酸为促染剂,使伊红容易着色,经酒精是不易脱色)。
经Ⅰ95%乙醇脱水2min
经Ⅱ95%乙醇脱水2min
经Ⅰ100%乙醇脱水1min
经Ⅱ100%乙醇脱水1min
浸入石炭酸二甲苯混合液(1:3)透明和吸水5min。
再经Ⅰ二甲苯1min洗净石炭酸,并使其更为透明。
再经Ⅱ二甲苯1min,切片自二甲苯中取出,用干纱布揩净切片以外的二甲苯,立刻滴上一小滴加拿大树胶液,并迅速用镊子取洁净盖玻片盖上(勿留气泡)。
结果:细胞核呈蓝紫色,细胞浆呈红色。
Harris氏苏木紫染色液配制法
甲液:苏木紫1g
100%乙醇10mL
(可稍加热使苏木紫溶解于酒精中)
乙液:钾明矾20g
蒸馏水200mL
(可稍加热使明矾溶解于蒸馏水中)
混合甲乙二液,煮沸后,即加氧化汞(HgO)0.5g,热至染液变深紫色,立即将烧瓶放入流动冷水中冷却。次日进行过滤,可暴露于日光中,使其氧化为苏木红,这个过程叫做成熟。使用时加冰醋酸4mL,可增加细胞核染色。