古菌氨氧化与amoA基因的扩增
近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究
中国石油大学（华东）毕业设计（论文）近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究学生姓名：学号：专业班级：环境工程指导教师：摘要胶州湾和海南岛海域优美的自然环境与独特的地质演化进程吸引了众多中外科学家的关注。
这种复杂的地质演化过程必然也伴随着生物的不断进化。
本实验中涉及的hzo和amoA基因序列可用于物种多样性的分析，相对于比较DNA所有序列，更简便并具有代表性。
本实验通过对胶州湾A5站位微生物hzo基因以及海南岛海域E505站位amoA基因的PCR扩增，转入感受态大肠杆菌，酶切分析，测序比功能比对等一系列步骤，分别建立这两站位的微生物系统树。
本实验所采集的样品来自于胶州湾和海南岛海域，实验采用对沉积物进行hzo和amoA基因文库构建进一步测序分析进化关系的方法。
通过建立的系统发育树可以对两个站位的微生物多样性进行评估。
本次实验证明胶州湾A5站位hzo基因多样性较少而海南岛海域E505站位amoA基因有较高多样性。
关键词：厌氧氨氧化；hzo基因；amoA基因ABSTRACTThe beautiful natural sceneries and the unique process of geological evolution of Jiaozhou Bay and Hainan Island waters are attracting more and more Chinese and foreign scientists. The complex geological evolution may go with continuous evolution of living beings.This study analyzed the archaeal and bacterial diversity by the construction of gene sequences that can be applied to the analysis of species diversity. In this experiment, sediment DNA from Jiaozhou Bay and Hainan Island coastal areas was extracted; hzo genes and amoA genes were amplified through PCR with degenerate primers justified by former researches, inserted into plasmids, which were then transformed with competent E.coli cells, analyzed by RFLP, and sequenced. After series of procedures, phylogenetic trees based on hzo and amoA genes were constructed, which is a good indication of microbe diversity.The sediment samples used in this study were collected from the Jiaozhou Bay and Hainan Island Waters. This study analyzed the archaeal and bacterial diversity by the construction of hzo and amoA gene libraries. From the two phylogenetic trees conducted, we can see hzo genes of staion A5 of Jiaozhou Bay has low diversity while amoA genes of station E505 of Hainan Island has high diversity.Keywords: Anammox; hzo genes; amoA genes目录第1章前言 (1)1.1 胶州湾生态环境 (1)1.2 厌氧氨氧化细菌 (1)1.3 该实验涉及的的分子生物学技术 (3)1.3.1 PCR技术 (3)1.3.2 限制性酶切 (6)1.3.3 琼脂糖凝胶电泳 (7)1.4 本文的研究目的及意义 (8)1.4.1 本文的研究目的 (8)1.4.2 本文的研究意义 (9)第2章实验部分 (10)2.1 材料及仪器 (10)2.1.1 胶州湾的地理位置及站位来源 (10)2.1.2 实验药品 (10)2.1.3培养基 (11)2.1.4主要仪器设备 (11)2.2 实验步骤 (12)2.2.1 宏基因组DNA的提取 (12)2.2.2 hzo与amoA基因序列的PCR扩增 (14)2.2.3 PCR产物的乙醇沉淀 (15)2.2.4 PCR产物纯化 (16)2.2.5 纯化PCR产物的连接 (16)2.2.6 感受态细胞的制备 (16)2.2.7 转化 (17)2.2.8 克隆的PCR扩增 (18)2.2.9 PCR产物酶切反应 (19)2.2.10 测序及保种 (19)2.2.11 测序结果分析 (20)第3章实验结果分析 (21)3.1 PCR图 (21)3.1.1 胶州湾A5站位PCR图 (21)3.1.2 海南岛海域E505站位PCR图 (23)3.2 酶切图 (25)3.2.1 胶州湾A5站位酶切图谱 (26)3.2.2 海南岛海域E505站位酶切图谱 (31)3.3 结果分析 (37)3.3.1 建立系统发育树 (37)3.3.2 结果分析与讨论 (37)致谢 (41)参考文献 (42)第1章前言1.1 胶州湾生态环境胶州湾位于胶南—威海造山带与胶莱坳陷东南缘的复合部位的中部，是黄海伸入内陆的天然海湾，地质构造复杂，具有港口、外贸、旅游和海洋科研等多种开发功能，对青岛的经济发展有着举足轻重的作用。
武汉东湖沉积物好氧氨氧化微生物时空分布
中国环境科学 2021,41(4)：1917~1924 China Environmental Science 武汉东湖沉积物好氧氨氧化微生物时空分布张志忠1,2,程德玺1,廖明军1,2,汪淑廉1,李祝1,2*(1.湖北工业大学土木建筑与环境学院,湖北武汉 430068；2.河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,湖北武汉 430068)摘要：采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,测定了武汉东湖沉积物中氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)氨单加氧酶基因(amoA)的丰度,并结合沉积物水体环境中各形态氮素的含量,分析氮素含量对AOA和AOB的时空分布的影响.结果显示, AOA amoA基因丰度大于AOB amoA基因丰度,表明AOA 对氨氧化过程的贡献较大.同时,AOA和AOB amoA基因丰度都随深度增加而降低.此外,间隙水的总氮、氨氮、硝酸盐氮以及亚硝酸盐氮浓度分别为6.28~33.56、2.71~22.7、0.12~0.98、0.01~0.13mg/L;上覆水的总氮、氨氮、硝酸盐氮以及亚硝酸盐氮平均浓度分别为1.68,0.79,0.16,0.04mg/L;表层水的总氮、氨氮、硝酸盐氮以及亚硝酸盐氮平均浓度分别为1.34,0.62,0.11,0.03mg/L,表明东湖东湖沉积物相对于水体呈营养盐可释放状态.相关性分析表明:AOA amoA基因丰度与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈显著正相关(P<0.05),AOB amoA基因丰度与间隙水亚硝酸盐氮(NO2--N)浓度呈显著正相关(P<0.05).关键词：实时荧光定量PCR；沉积物；氨氧化古菌；氨氧化细菌；丰度中图分类号：X524 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2021)04-1917-08Spatiotemporal distribution of aerobic ammonia-oxidizing microorganisms in sediments of Lake Donghu, Wuhan.ZHANG Zhi-zhong1,2, CHENG De-xi1, LIAO Ming-jun1,2, WANG Shu-lian1, LI Zhu1,2* (1.School of Civil Engineering, Architecture and Environment, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China；2.Hubei Key Laboratory of Ecological Remediation for Rivers-Lakes and Algal Utilization, Wuhan 430068, China). China Environmental Science, 2021,41(4)：1917~1924Abstract：The amoA gene abundances of ammonia-oxidizing archaea (AOA-amoA) and bacteria (AOB-amoA) in the sediments of Lake Donghu, Wuhan, was determined by the real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Moreover, the influence of nitrogen content on the temporal and spatial distribution of AOA and AOB was analyzed. The results showed that the abundance of AOA-amoA was higher than that of AOB-amoA, indicating greater contribution of AOA-amoA to the ammonia oxidation process. Meanwhile, the abundances of AOA-amoA and AOB-amoA decreased with elevated sediment depth. In addition, the concentrations of total nitrogen (TN), ammonia nitrogen (NH4+-N), nitrate nitrogen (NO3--N) and nitrite nitrogen (NO2--N) in interstitial water were 6.28~33.56, 2.71~22.7, 0.12~0.98 and 0.01~0.13mg/L, respectively. The average concentrations of TN, NH4+-N, NO3--N and NO2--N in overlying water were 1.68, 0.79, 0.16 and 0.04mg/L, respectively, while in surface water were 1.34, 0.62, 0.11 and 0.03mg/L, respectively. These results suggested that the sediments of Lake Donghu were important sources of nutrient. In addition, the abundance of AOA-amoA was positively correlated with the concentrations of NH4+-N and NO2--N in interstitial water (P<0.05), while the abundance of AOB-amoA was positively correlated with the concentration of NO2--N in interstitial water (P<0.05).Key words：qPCR；sediment；ammoxidation archaea；ammonia oxidizing bacteria；abundance沉积物作为湖泊水体中氮的重要“源”和“汇”,是水体中氮的主要贡献者[1-2].栖息于沉积物中的部分微生物通过参与氮循环过程,包括氮的固定、硝化作用、反硝化作用和氨氧化作用[3],促进氮的转化.其中氨氧化作用作为硝化作用的首要环节,是硝化过程的关键限速反应[4].氨氧化作用的速率取决于氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的丰度[5].而AOA与AOB在不同的生境中,受温度、溶解氧、有机质、pH值、氮素浓度和盐度等环境因子的影响,两者的丰度、群落结构、多样性以及氨氧化效率等不尽相同[6-8],氨氧化微生物的分布与氮循环氨氧化过程之间的联系复杂.由于生理生化机制的差异,AOA与AOB具有不同的环境偏好[9-10].在大多数湖泊环境中,AOA的丰度均高于AOB[11-12],但也存在AOB的丰度高于AOA的情况[13-15].总体来说,AOA往往在低pH值、低氧和寡营养的条件下比AOB更占优势.在巢湖以及太湖的沉积物中,AOA的丰度与硝酸盐氮浓度呈收稿日期：2020-08-24基金项目：国家自然科学基金资助项目(51579092,51879099);国家重点基础研究项目(2016YFC0401702);广东省水利科技创新项目(2017—14)* 责任作者, 副教授,****************1918 中国环境科学 41卷显著负相关,AOB的丰度与氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈显著正相关[14].而在若尔盖花湖的沉积物中,总氮、氨氮、硝酸盐氮以及亚硝酸盐氮与AOA的丰度均呈显著正相关[16].造成不同湖泊中氮素含量与好氧氨氧化微生物分布之间联系差异的原因尚不明确,需要进一步研究.根据近几年对武汉东湖各子湖水质的监测结果发现,牛巢湖水质为Ⅳ类,官桥湖水质为劣Ⅴ类,郭郑湖水质状况次于牛巢湖.其次,牛巢湖靠近风景区,周边污染源较少,官桥湖和郭郑湖靠近学校生活区,有利于对比研究.因此,本研究选取具有代表性的郭郑湖、官桥湖、牛巢湖作为研究对象,监测表层水、上覆水及沉积物间隙水中的氮素浓度.同时,采集沉积物泥样提取泥样中微生物的DNA,采用实时荧光定量PCR 技术,以功能基因amoA作为分子标记,定量分析沉积物中AOA和AOB amoA基因丰度.研究AOA和AOB 在沉积物中不同时空以及深度下的分布特征,分析其与表层水、上覆水和沉积物间隙水中氮素浓度之间的相关性.旨在揭示武汉东湖不同营养水体中氨氧化微生物的动态变化,为进一步研究湖泊沉积物氮循环机理和开展湖泊生态修复提供理论参考.1材料与方法1.1样品采集本研究以东湖为研究对象,在东湖子湖郭郑湖(采样点A)、官桥湖(采样点B)和牛巢湖(采样点C)各设置一个采样点(图1).采样坐标为A:(30°33'19''N, 114°23’26''E);B:(30°31'51''N,114°23'31''E); C:(30°33'39''N, 114°25'43''E).采样时间为2016年7月30日、2016年11月28日、2017年4月4日及2017年9月10日,分别代表夏(SU)、冬(WI)、春(SP)、秋(AU)4个季节.沉积物采样的同时采集表层水、上覆水和间隙水.A(30°33′19″N,114°23′26″E)(30°31′51″N,114°23′31″E)BC(30°33′39″N,114°25′43″E)图1 东湖采样点Fig.1 Sampling sites in Lake Donghu1.2理化性质测定以《水和废水监测分析方法》第四版[17]方法测定硝酸盐氮(NO3--N)、亚硝酸盐氮(NO2--N)、氨氮(NH4+-N)以及总氮(TN).参考国标《CJ/T221-2005》[18]方法测定沉积物含水率.1.3 AOA和AOB丰度测定1.3.1 沉积物DNA的提取参考陆诗敏等[19]报道的方法,提取沉积物中总基因组.以λ-Hind DNAⅢMaker为标准,在1%的琼脂糖凝胶电泳上进行检测,观察目的基因是否有条带,用Nanodrop ND-1000测定样品的浓度及纯度,-20℃保存,以待后续分析.表1氨氧化微生物amoA基因PCR扩增引物及条件Table 1 Primers and procedures for PCR amplification of amoA genes目的基因引物引物序列(5’-3’) 反应条件AOA amoA CrenamoA23f CrenamoA616rATGGTCTGGCTWAGACGGCCATCCABCKRTANGTCCA[20]95,30s;(95,5s,53,1min,72,1min)×35℃℃℃℃AOB amoA amoA-1F amoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC[21]95,30s,(95,5s,54,35s,72,1min)×35℃℃℃℃1.3.2 标准质粒的构建 AOA和AOB所用的PCR 引物、扩增的目的片段及扩增条件见表1,扩增体系为:2μL模板,上下游引物各0.25μL (10μmol/L), 2× Taq Master Mix 10μL加上无菌双蒸水补足至20μL. PCR产物经切胶纯化后,用DNA连接试剂盒将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T载体上,产物再经过转化、筛选后测序.AOA和AOB amoA序列的阳性质粒克隆菌株用LB液体培养基扩大培养,用TIAN prep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒提取质粒备用.1.3.3AOA和AOB amoA基因丰度测定采用SYBR Green法进行qPCR,反应体系使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ替代普通PCR反应体系中的4期 张志忠等：武汉东湖沉积物好氧氨氧化微生物时空分布 19192×Taq Master Mix,其余条件与普通PCR 相同,得到标准曲线.每次扩增都设置阴性对照组,分别对4个季节中3个子湖的不同分层沉积物样品中的AOA 和AOB amoA 基因进行扩增,得到每个样品提取的DNA 中amoA 基因丰度. 1.4 数据处理与分析利用Originpro 2019b 软件对东湖表层水、上覆水以及间隙水理化指标数据进行处理,利用SPSS 22.0统计分析软件对丰度和环境因子数据进行方差分析和相关性分析. 2 结果与分析 2.1 表层水、上覆水和间隙水不同季节氮含量的变化如图2(a)所示,表层水的总氮、氨氮、硝酸盐氮以及亚硝酸盐氮平均浓度分别为1.34,0.62,0.11, 0.03mg/L.在4个季节中,官桥湖的表层水中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮和总氮的含量均显著高于郭郑湖和牛巢湖(P <0.05).对于不同的季节而言,3个子湖表层水中春季总氮含量最高,而秋季总氮含量最低.对于同一子湖的表层水,3种无机氮中氨氮含量明显高于硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量,且氨氮的含量与总氮含量变化一致,而硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量较低且无明显变化趋势.如图2(b),上覆水的总氮、氨氮、硝酸盐氮以及亚硝酸盐氮平均浓度分别为1.68,0.79,0.16,0.04mg/ L.与表层水相似,在4个季节中官桥湖的上覆水中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮和总氮的含量均显著高于牛巢湖和郭郑湖(P <0.05).同时,官桥湖春季上覆水中总氮含量远高于其它季节,而郭郑湖和牛巢湖的上覆水在不同季节中的氮含量无明显差异(P > 0.05).同样地,上覆水中3种无机氮中氨氮含量最高,且氨氮含量的变化趋势与总氮一致,而硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量较低且无明显变化趋势.如图2(c),间隙水的总氮、氨氮、硝酸盐氮以及亚硝氮浓度分别为6.28~33.56、2.71~22.7、0.12~ 0.98、0.01~0.13mg/L.分析3个子湖表层沉积物(0~ 5cm)间隙水在不同季节氮含量的变化,发现氮的各种存在形态在间隙水中的含量比在表层水和上覆水中的含量高.官桥湖的表层沉积物间隙水中氨氮和总氮的含量显著高于牛巢湖和郭郑湖(P <0.05),而硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量在3个子湖中则无明显差异(P >0.05).对于同一子湖中无机氮的含量,氨氮含量最高,其次是硝酸盐氮,亚硝酸盐氮含量最低.综上分析,硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的含量在表层水、上覆水和间隙水中无明显差异;而对于总氮和氨氮的含量依次是间隙水>上覆水>表层水.表明3个子湖的氨氮在4个季节中不断由沉积物向湖水中释放,导致湖水中氨氮和总氮浓度不断上升,这可能是东湖一直处于重度污染的内在原因.图2 不同季节研究水体中4种氮素含量变化情况Fig.2 Changes of four nitrogen contents in water in different seasons2.2 AOA 与AOB amoA 基因丰度时空分布特征东湖3个子湖中AOA 与AOB 丰度有明显的季节差异性;同时,在沉积物的分层采样结果中发现,丰度随空间变化较大,结果见图3.1920 中 国 环 境 科 学 41卷不同季节中AOA amoA 基因丰度不同,春季的丰度为4.50×105~3.68×108copies/g,夏季的丰度为8.07×105~1.58×108copies/g,秋季的丰度为6.21×105~ 4.99×108copies/g,冬季的丰度为8.27×105~4.13× 108copies/g.同样的,AOB amoA 基因丰度在不同的季节也明显不同,春夏秋冬4个季节中AOB amoA 基因丰度分别为1.14×105~5.32×106,1.66×104~1.14× 106,9.57×104~4.21×106和5.18×104~8.89×105copies/ g.总体来看,AOA amoA 基因丰度在夏季最高,而在其它3个季节无明显差异(P >0.05);AOB amoA 基因丰度在春季最高,冬季最低,而在其它2个季节无明显差异(P >0.05).不同深度沉积物的AOA amoA 基因丰度见图3(a)~(d).表层沉积物丰度为 2.38×106~4.99× 108copies/g,中层沉积物AOA amoA 基因丰度为6.21×105~1.25×108copies/g,底层沉积物丰度为4.50× 105~5.06×107copies/g.在东湖的3个子湖中,夏季AOA amoA 基因丰度随着采样深度的增加而降低,官桥湖的AOA amoA 基因丰度比郭郑湖和牛巢湖高(图3a).而在春、秋和冬季,AOA 主要存在于表层沉积物中(0~5cm),而在5cm 以下的深度,基本无AOA 的存在,且都在0~1cm 深度时AOA 丰度最大;在这3个季节中,在0~1cm 深度均是官桥湖中AOA amoA 基因丰度最高,郭郑湖次之,牛巢湖最低(图3b -d).图3 不同季节研究区域沉积物中AOA 和AOB amoA 基因丰度垂直分布Fig.3 The vertical distribution of amoA gene abundance of AOA and AOB in sediments of different seasons不同深度沉积物的AOB amoA 基因丰度见图3(e)~(h).表层沉积物AOB amoA 基因丰度为1.25×105~5.32×106copies/g,中层和底层沉积物AOB amoA 基因丰度分别为7.31×104~7.68×105copies/g 和1.66×4期张志忠等：武汉东湖沉积物好氧氨氧化微生物时空分布 1921104~5.15×105copies/g.在夏季和冬季,3个子湖不同深度(0~20cm)沉积物中均有AOB的分布,表层(0~5cm)AOB amoA基因丰度最高;在夏季最高的是郭郑湖,而冬季最高的是官桥湖.在春季和秋季,AOB 主要分布在0~4cm深度,同样是在表层(0~1cm)最高;在春季最高的是官桥湖郭郑湖,而冬季最高的是郭郑湖.2.3 AOA/AOB(amoA基因丰度比)在所有采样点中,AOA amoA基因丰度均高于AOB,AOA/AOB为2~546.相关性分析表明,AOA amoA基因丰度与AOB amoA基因丰度呈极显著正相关(P<0.01,相关系数为0.572).如图4所示,郭郑湖和牛巢湖的AOA/AOB在夏季均呈现先增加后降低的变化趋势,郭郑湖AOA/AOB在15~20cm达到峰值(图4a),而牛巢湖AOA/AOB在10~15cm达到峰值(图4c).在其他季节,AOA/AOB在不同深度变化不大.图4 不同子湖AOA/AOB(amoA基因丰度比)垂直变化Fig.4 Vertical variation of AOA/AOB(ratio of amoA gene abundance) in different sub-lakes2.4 氨氧化微生物amoA基因丰度与间隙水理化性质相关性如表2所示,夏季AOA amoA基因丰度与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈极显著正相关(P<0.01), AOB amoA基因丰度与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈极显著正相关(P<0.01);冬季AOA amoA基因丰度与间隙水氨氮浓度呈显著正相关(P<0.05),AOB amoA基因丰度与间隙水亚硝酸盐氮浓度呈显著正相关(P<0.05);AOA/AOB与间隙水硝酸盐氮呈显著正相关(P<0.05);秋季AOA/AOB与氨氮呈显著负相关(P<0.05).按照不同沉积物层数来分类,中层沉积物AOA amoA基因丰度与间隙水氨氮浓度呈显著正相关(P<0.05).按照不同子湖来分类,官桥湖AOA和AOB amoA基因丰度均与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈极显著正相关(P<0.01),AOB amoA基因丰度与间隙水总氮浓度呈显著负相关(P<0.05),AOA/AOB与氨氮呈显著正相关(P<0.05).表2 AO A和AOB amoA基因丰度与间隙水氮浓度皮尔逊相关系数Table 2 Pearson correlation coefficients between AOA andAOB amoA gene abundance and nitrogen content ininterstitial water项目 AOAamoA基因丰度AOB amoA基因丰度AOA/AOB硝酸盐氮0.097 0.136-0.242*亚硝酸盐氮0.294** 0.215*0.100氨氮 0.215* 0.103 0.127总氮-0.101 -0.177 0.100注:* P<0.05 ; **P<0.01.1922 中国环境科学 41卷3 讨论AOA和AOB广泛生存于水生环境中, 氨氮作为氨氧化微生物的基质,与氨氧化微生物丰度关系密切[22].一般而言,在低氨的贫营养水体中,AOA占绝对优势[23],而AOB生长受到限制.适当提高氨氮浓度会提高AOA的生长速率[24].3个子湖间隙水中,官桥湖的氨氮要显著高于郭郑湖和牛巢湖,这很可能是官桥湖沉积物中AOA远高于其他2个子湖的原因.同时,3个子湖不同季节不同深度的沉积物中, AOA amoA基因丰度高于AOB,可能是由于3个子湖间隙水的氨氮浓度为2.71~22.7mg/L,有利于AOA 生存而限制AOB生长[25].因此推测东湖属于一个低氨氮环境,导致AOB生长受氨氮影响被抑制.AOA 处于优势地位,表明AOA可能在东湖沉积物氨氧化过程中发挥着主要作用.湖泊沉积物生境较为复杂,也存在其他环境因子对氨氧化微生物分布有不同程度影响的可能性,在目前的研究中已发现NO3--N、NH4+-N、TOC 、TP、TN和pH值等因素对AOA amoA基因丰度的影响较多,AOB amoA 基因丰度受NO3--N、NH4+-N和pH值的影响更多[22].夏季AOA amoA基因丰度与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈极显著正相关,冬季AOA amoA基因丰度只与间隙水氨氮浓度呈显著正相关,原因可能是冬季温度低,AOA的代谢活性降低,较少的氨氮转化为亚硝酸盐氮,导致亚硝酸盐氮的浓度降低.夏冬季节AOB amoA基因丰度与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度分别呈极显著正相关和显著正相关,表明温度变化对AOB的代谢活性影响不大.而在沉积物不同分层水平上,仅中层沉积物AOA amoA基因丰度与间隙水氨氮浓度呈显著正相关,这可能与沉积物中溶解氧和有机质有关.对于不同子湖,官桥湖AOA和AOB amoA基因丰度均与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈极显著正相关.3个子湖中官桥湖水质最差、富营养化最严重,可能是由于官桥湖间隙水的氨氮浓度适宜氨氧化微生物生长,而亚硝酸盐氮浓度对好氧氨氧化微生物无明显的抑制作用.不同季节带来的温度差异会影响AOA和AOB amoA基因丰度.在3个子湖表层和中层沉积物中,AOA amoA基因丰度在夏季明显高于其他3个季节.这与Auguet等[26]人在研究高山湖泊中泉古菌分布规律时发现的AOA amoA基因丰度在夏季最高,在春季和冬季均有下降趋势相一致. 在东湖表层沉积物中,AOB amoA基因丰度在冬季显著低于其他3个季节,在春季显著高于其他3个季节.不同季节对于AOB amoA基因丰度的影响因素可能在于温度的差异.温度是影响AOB分布的关键性因素,同时随着季节的变化,氨浓度和pH值也会改变,从而影响AOB的群落结构[27].Avrahamk等[28]人发现,在土壤中的湿度、氨氮和pH值处于稳定状态时,AOB amoA 基因丰度以及其硝化活性在15~25℃时最高.这与Godde等[29]研究的N2O释放率中温时低而低温时高的结论恰好相反,其原因可能在于两者所研究对象的营养水平不同.因此,在研究氨氧化微生物不同季节分布特征时,各种因素对其的影响情况不能一概而论,应结合实地水文、水质等情况深入研究.普遍发现在空间垂直方向上,随着沉积物深度的增加,AOA与AOB amoA基因丰度均有下降的趋势[16,30-32],本研究中AOA与AOB amoA基因丰度在垂直方向上的变化趋势亦是如此,这可能与溶解氧浓度的变化有关.AOA和AOB均属于好氧型,随深度的增加,溶解氧浓度逐渐降低,amoA基因丰度逐渐减少.在东湖沉积物中,AOA和AOB amoA基因丰度都在0~1cm最高,在前3cm迅速下降,然后趋于平缓.这表明表层沉积物与上覆水氧气交换频繁,溶解氧浓度相对较高,该趋势与其他关于氨氧化微生物垂直分布的研究结论一致[33-34].对于同一季节,秋季的官桥湖和郭郑湖以及冬季的官桥湖沉积物中随着深度增加,AOA/AOB呈上升的趋势.这与AOA比AOB更适于厌氧浓度条件有关[35].亚硝酸盐氮作为氨氧化反应的产物,其浓度也会影响AOA和AOB amoA基因丰度[36].本研究中发现AOA/AOB与硝酸盐氮呈显著负相关. AOA 广泛地分布于海洋、土壤、沉积物这样的中好氧到缺氧的环境中[37],相比于AOB, AOA更适应缺氧的环境,硝酸盐氮作为硝化反应的最终产物,其浓度一定程度上反映了氧气浓度的多少,硝化速率越低的区域其溶解氧一般越低,而AOA比AOB更耐低氧环境,所以硝酸盐氮越低的区域,其AOA/AOB反而较高.湖泊沉积物中氮循环相关的微生物受多种环境因子的影响,比如溶解氧以及有机质含量.溶解氧4期张志忠等：武汉东湖沉积物好氧氨氧化微生物时空分布 1923会影响氨氧化微生物的丰度,进而影响间隙水氨氮的浓度;高的有机质含量会使异养细菌(如硝化细菌)的丰度增加,从而降低亚硝酸盐氮的浓度,减低亚硝酸盐氮对好氧氨氧化微生物的产物抑制作用.从而达到增加氨氧化微生物的氨氧化活性,降低氨氮浓度的目的.因此可以通过生物法如种植水生植物使溶解氧含量升高,以及向湖泊沉积物投加外源碳增加有机质含量等措施来实现定向促进氨氮向亚硝酸盐氮的转化.4 结论4.1 武汉东湖不同水层各营养盐(氮)浓度表现为间隙水>上覆水>表层水, 上覆水的总氮和氨氮浓度显著高于表层水,显示东湖沉积物相对于水体呈营养盐可释放状态.4.2 武汉东湖沉积物中AOA amoA基因丰度为4.50×105~4.99×108copies/g,AOB amoA基因丰度为1.66×104~5.32×106copies/g,AOA/AOB amoA基因丰度比为2~546,AOA可能在东湖沉积物氨氧化过程中发挥着主要作用.4.3 AOA和AOB amoA基因丰度随沉积物深度增加而降低.在夏季,AOA amoA基因丰度在15cm以上的沉积物中下降速率更快,AOB amoA基因丰度在15cm以上的沉积物中下降速率更快,其他3个季节普遍在前3cm快速下降,之后趋于平缓.4.4 AOA amoA基因丰度与间隙水氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈显著正相关(P<0.05);AOB amoA基因丰度与间隙水亚硝酸盐氮浓度呈显著正相关(P<0.05); AOA/AOB amoA基因比值与间隙水硝酸盐氮呈显著负相关(P<0.05).参考文献：[1] 朱元荣,张润宇,吴丰昌.滇池沉积物中氮的地球化学特征及其对水环境的影响 [J]. 中国环境科学, 2011,31(6):978-983.Zhu Y R, Zhang R Y, Wu F C. Geochemical characteristics and influence to overlying water of nitrogen in the sediments from Dianchi Lake [J]. China Environmental Science, 2011,31(6):978-983.[2] 吉芳英,颜海波,何强,等.龙景湖龙景沟汇水区沉积物-水界面氮形态空间分布特征 [J]. 中国环境科学, 2015,35(10):3101-3107.Ji F Y, Yan H B, He Q, et al. Distribution of nitrogen speciation at the sediment-water interface in Longjinggou Catchment Area of Longjinghu Lake [J]. China Environmental Science, 2015,35(10): 3101-3107.[3] 刘正辉,李德豪.氨氧化古菌及其对氮循环贡献的研究进展 [J]. 微生物学通报, 2015,42(4):774-782.Liu Z H, Li D H. Ammonia-oxidizing archaea and their contribution to global nitrogen cycling: a review [J]. Microbiology China, 2015, 42(4):774-782.[4] 郭佳.典型环境因子对硝化作用和氨氧化微生物生理生态的影响[D]. 重庆:西南大学, 2016.Guo J. The influence of typical environmental factors on nitrification and physiological ecology of ammonia-oxidazers [D]. Chongqing: Southwest University, 2016.[5] 苏瑜,王为东.我国北方四类土壤中氨氧化古菌和氨氧化细菌的活性及对氨氧化的贡献 [J]. 环境科学学报, 2017,37(9):3519-3527.Su Y, Wang W D. Activity of AOA and AOB and their contributions to ammonia oxidization in four soils in North China [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2017,37(9):3519-3527.[6] Zheng Y L, Hou L J, Newell S, et al. Community Dynamics andActivity of Ammonia-oxidizing Prokaryotes in Intertidal Sediments of the Yangtze Estuary [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014,80(1):408-419.[7] Liu S, Shen L D, Lou L P, et al. Spatial Distribution and FactorsShaping the Niche Segregation of Ammonia-Oxidizing Microorganisms in the Qiantang River, China []. Applied and Environmental Microbiology, 2013,79(13):4065-4071.[8] Vissers E W, Anselmetti F S, Bodelier P L E, et al. Temporal andspatial coexistence of archaeal and bacterial amoA genes and gene transcripts in Lake Lucerne [J]. Achaea, 2013,2013(12):289478.[9] Martens-Habbena W, Berube P M, Urakawa H, et al. Ammoniaoxidation kinetics determine niche separation of nitrifying Archaea and Bacteria [J]. Nature, 2009,461(7266):976-979.[10] Erguder T H, Boon N, Wittebolle L, et al. Environmental factorsshaping the ecological niches of ammonia-oxidizing archaea [J].FEMS Microbiology Reviews, 2009,33(5):855-869.[11] Herrmann M, Saunders A M, Schramm A. Effect of lake trophic statusand rooted macrophytes on community composition and abundance of ammonia-oxidizing prokaryotes in freshwater sediments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009,75(10):3127-3136.[12] Auguet J C, Triadó-Margarit X, Nomokonova N, et al. Verticalsegregation and phylogenetic characterization of ammonia-oxidizing Archaea in a deep oligotrophic lake [J]. The ISME Journal, 2012,6(9): 1786-1797.[13] Wu Y C, Xiang Y, Wang J J , et al. Heterogeneity of archaeal andbacterial ammonia-oxidizing communities in Lake Taihu, China [J].Environmental Microbiology Reports, 2010,2(4):569-576.[14] Hou J, Song C L, Cao X Y, et al. Shifts between ammonia-oxidizingbacteria and archaea in relation to nitrification potential across trophic gradients in two large Chinese lakes (Lake Taihu and Lake Chaohu) [J].Water Research, 2013,47(7):2285-2296.[15] J iang H C, Dong H L, Yu B S, et al. Diversity and abundance ofammonia-oxidizing archaea and bacteria in Qinghai Lake, Northwestern China [J]. Geomicrobiology J ournal, 2009,26(3): 199-211.[16] 丁浩,徐慧敏,苏芮,等.若尔盖花湖沉积物氨氧化与反硝化功能基因丰度垂向分布特征及其环境响应 [J]. 环境科学学报, 2019, 39(10):3482-3491.1924 中国环境科学 41卷Ding H, Xu H M, Su R, et al. Vertical distribution and environmental response of the abundance of ammonia-oxidizing and denitrifying functional genes in sediments of Huahu Lake in Zoige [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2019,39(10):3482-3491.[17] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法 [M]. 北京:中国环境科学出版社, 2002:258-285.State Environmental Protection Administration. Water and Wastewater Monitoring and Analysis Methods [M]. Beijing:China Environmental Press, 2002:258-285.[18] CJ/T 221-2005 城市污水处理厂污泥检验方法 [S].C/T 221-2005 Determination method for municipal sludge in wastewater treatment plant [S].[19] 陆诗敏.淡水养殖池塘环境中氨氧化微生物的研究 [D]. 武汉:华中农业大学, 2014.Lu S M. Study on the ammonia-oxidizing microorganisms in the freshwater aquaculture pond environment [D]. Wuhan;Huazhong Agricultural University, 2014.[20] ian Y, iang H, Dong H, et al. amoA-encoding archaea andthaumarchaeol in the lakes on the northeastern Qinghai-Tibetan Plateau, China [J]. Frontiers in Microbiology, 2013,4(329):329. [21] Ju X, Wu S, Huang X, et al. How the novel integration of electrolysisin tidal flow constructed wetlands intensifies nutrient removal and odor control [J]. Bioresour Technol, 2014,169:(605-613)[22] 贾仲君,翁佳华,林先贵,等.氨氧化古菌的生态学研究进展 [J]. 微生物学报, 2010,50(4):431-437.J ia Z G, Weng J H, Lin X G, et al. Microbial ecology of archaeal ammonia oxidation—A review [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010,50(4):431-437.[23] Yang Y Y, Zhang J G, Zhao Q, et al. Sediment Ammonia-OxidizingMicroorganisms in Two Plateau Freshwater Lakes at Different Trophic States. [J]. Microbial ecology, 2016,71(2):257-265.[24] 王萃.密云水库库滨区土壤和底泥中氨氧化微生物的群落特征及与环境因子的响应关系 [D]. 北京:首都师范大学, 2014.Wang C. Community characteristics of ammonia-oxidizing microorganisms and their response to environmental factors in soil and sediment of Miyun Reservoir riparian area [D]. Beijing: Capital Normal University, 2014.[25] 周磊榴,祝贵兵,王衫允.洞庭湖岸边带沉积物氨氧化古菌的丰度、多样性及对氨氧化的贡献 [J]. 环境科学学报, 2013,33(6):41-47.Zhou L L, Zhu G B, Wang S Y. Abundance, biodiversity and contribution to ammonia oxidization of ammonia-oxidizing archaea in littoral sediments of Dongting Lake [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2013,33(6):41-47.[26] Auguet J C, Casamayor E O. A hotspot for cold crenarchaeota in theneuston of high mountain lakes [J]. Environmental Microbiology, 2008,10(4):1080-1086.[27] 董莲华,杨金水,袁红莉.氨氧化细菌的分子生态学研究进展 [J]. 应用生态学报, 2008,19(6):81-85.Dong L H, Yang J S, Yuan H L. Research progress in molecularecology of ammonia-oxidizing bacteria []. Chinese ournal of Applied Ecology, 2008,19(6):81-85.[28] Avrahamk S, Liesack W, Conrad R. Effects of temperature andfertilizer on activity and community structure of soil ammonia oxidizers [J]. Environmental Microbiology, 2003,5(8):691–705. [29] Godde M, Conrad R. Immediate and adaptational temperature effectson nitric oxide production and nitrous oxide release from nitrification and denitrification in two soils [J]. Biology & Fertility of Soils, 1999,30(1/2):33-40.[30] Lipsewers Y A, Hopmans E C, Meysman F J R, et al. Abundance andDiversity of Denitrifying and Anammox Bacteria in Seasonally Hypoxic and Sulfidic Sediments of the Saline Lake Grevelingen. [J].Frontiers in microbiology, 2016,7(1661):1-15.[31] Mylène H, Sandrine E, Antoine B, et al. Dynamics of ammonia-oxidizing Archaea and Bacteria in contrasted freshwater ecosystems [J]. Research in Microbiology, 2013,164(4).[32] 郑鹏飞,张晓黎,龚骏.大叶藻(Zostera marina)海草床沉积物细菌和古菌丰度及组成的垂直剖面特征 [J]. 微生物学通报, 2020,47(6): 1662-1674.Zheng P F, Zhang X L, Gong J. Vertical patterns of bacterial and archaeal abundance and community Vertical patterns of bacterial and archaeal abundance and community [J]. Microbiology China, 2020, 47(6):1662-1674.[33] 古小治,张启超,孙淑雲,等.富氧-缺氧过程对氧气分布及交换过程影响 [J]. 中国环境科学, 2015,35(5):1495-1501.Gu X Z, Zhang Q C, Sun S Y, et al. Influence of anaerobic and aerobic processes on bottom oxygen dynamic and exchange process across sedimentwater interface [J]. china environmental science, 2015,35(5): 1495-1501.[34] 于少兰,乔延路,韩彦琼,等.好氧氨氧化微生物系统发育及生理生态学差异 [J]. 微生物学通报, 2015,42(12):2457-2465.Yu S L, Qiao Y L, Han Y Q, et al. Differences between ammonia- oxidizing microorganisms in phylogeny and physiological ecology [J].Microbiology China, 2015,42(12):2457-2465.[35] Abell G C, Banks J, Ross D J, et al. Effects of estuarine sedimenthypoxia on nitrogen fluxes and ammonia oxidizer gene transcription [J]. Fems Microbiology Ecology, 2011,75(1):111-122.[36] 鲍林林,陈永娟,王晓燕.北运河沉积物中氨氧化微生物的群落特征[J]. 中国环境科学, 2015,35(1):179-189.Bao L L, Chen Y , Wang X Y. Diversity and abundance of ammonia-oxidizing prokaryotes in surface sediments in Beiyun River [J]. china environmental science, 2015,35(1):179-189.[37] Wang X L, Han C, Zhang J B, et al. Longterm fertilization effects onactive ammonia oxidizers in an acid upland soil in China [J] Soil Biology and Biochemistry, 2015,84:28-37.作者简介：张志忠(1996-),男,湖北仙桃人,湖北工业大学硕士研究生,主要研究方向环境微生物生态.发表论文1篇.。
污水处理中氨氧化古菌的富集培养ppt
点击此处添加标题
图4．富集物中HJ-2b 菌的扫描电镜观察(50000×)
富集 AOA 的生长和代谢特性
对一个周期内AOA富集培养基的氨氮、亚硝态氮，16S rＲNA基因 拷贝数和amoA基因拷贝数进行连续监测，得到的结果如图5所示。 氨氮的降解在第10天的时候全部完成，同时生成的亚硝态氮趋于稳
HJ-2b在16S rＲNA基因和 amoA基因的进化关系上产生
了较大的差异，换用不同的引
物检测之后,该差异仍然存在。 这是在之前的AOA富集中从未 被报道过的。一种可能的解释 是HJ-2b菌的amoA基因并不是
sp．JG1的16S rＲNA基因相似度
达到100%，但在amoA基因的进 化关系上却与之相距较远，且细 胞形态有较大差异，是不同 Nitrososphaerasp．JG1的一种
富集 培养基
(Decode DGGE，伯乐)， 凝胶成像仪 (Gel Doc XＲ，伯乐) 紫外分光光度计 (DＲ5000，哈希) 环境扫描电子显微镜 (Quanta200，FEI)
2 材料方A 基因的检测及系统发育分 析 16S rＲNA 基因 和 amoA 基因的 定量
株。这些菌株都是从海洋沉积物、土壤、热泉等自然环境中富集得到。到目前为止，还没有从污水处理系统( 活性污 泥) 中富集分离 AOA 的报道。污水处理系统依靠氨氧化反应来去除氨氮，研究者在国内外多个污水处理系统中均发 现了 AOA，在部分系统中，AOA 的数量甚至超过 AOB 几个数量级。但与 AOB 不同的是，并非每一个氨氮去除效 果良好的系统中都能发现 AOA 的存在。研究者对于影响 AOA 存在性的因素做出了多种不同的猜测，包括氨氮浓
氨单加氧酶基因（amoa）在氨氧化细菌种群分析和定量检测中的应用研究
浙江大学硕士学位论文氨单加氧酶基因（amoA）在氨氧化细菌种群分析和定量检测中的应用研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：***20030601浙江大学硼士学位论文摘要嫩物脱氮法是现代工业污水处理中普遍采用的～种方法，其中由硝化细菌竞残豹鞘他反应是褥氨氮麸污窳中去豫最必关键懿一步。
蠹然装撬下筑化能无机自养硝化细菌其有生长速率低、生物墩小和对环境因子敏感等生理特点，使褥污永处理厂麓脱氮效果缀不稳定。
为了磺究脱氮系统的运｛亍情况，我们以两个潜水处理系统的活性污泥样品为实验对象，运用ＭＰＮ．ＰＣＲ法对其中的氨氧化细菌迸彳亍快速定量检测。
同时通过测定水样中氨氮含量的变化来推冀硝化速率。
研究表骧，生物腮氮系统中硝化细蘩的数鬃和活性可以ｌ乍为判断该系统生物脱氮效果好坏的重隳标准。
氮襞纯缨蓠是硝纯蔻癸熬一个重要缀残部分，它瓣秘类隧生境蓑舞瑟考所不同。
为了分析污水处理系统中氨氟化细菌的种群组成，筛选合成了一对对氨襞纯纲蘩瓣｜碰蒸嚣特舅结合静萼｜耱痔翻，稍翔ｐｃＲ援零对觚滔槛污泥中抽提的细菌总Ｄ１ｑＡ进行扩增，结含１’Ａ克隆和ＤＮＡ测序技术，得到不同重组予疗聊叫序两旁段。
运用ＢＬＡｓＴ程序将颡４序结果与基因簿中的公开序列进行比较，发现在该澎水处理系统中分布有大囊Ⅳｆｆｍ，彻｛Ｄ撇，属纲萤，其中最主鬻的是Ⅳｆ打协ＤｍＤ栉∞Ｐ姗ｑ溯８口菌种。
由此推测Ⅳｆ棚ｓＤｍＤ，“捕属细菌在该系统的氮氧化ｊ窭程孛怒主导律霜。
进一步运震ｃｌ嘲１ｗ软髂对藏的鼢掰Ｄ撵甜属下不同菌种的册叫基因片段的同源性进行比较，并采用ＰＨＹＬＩＰ软件包对册ｌ蒯基嚣黪系绞发育关系遴行骚究，建立了＋个蘩耱魏系统发育避｛乏耱。
关键词：氨戴纯缨鼙册鲥基困’序列分析污永处璃———＿—＿——＿－Ⅷ＿，－—＿ｗⅢｕ———√－＿＿——＾＿———＿—。
’Ⅷ。
’。
———“—４十—‘。
＿一浙江太学硕士学位论文Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｆ区晰ｎ４ＧｅｎｅｉｎＰ０ｐｕｌａｔｉＯｎａｎｄＱ私ａＨｌｉ拯娃ｖｅＡｎａ玲ｓ氧ｆｏｒＡ掇ｍｏ秘ｉ臻—ｏｘｉｄｉｚｉ珏ｇＢａｅ蚀菇ａＡＢＳ霉ＲＡＣ譬Ｂｉｏｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｓａｕｎｉｖｅｒ８ａｌｍｅｍｏｄｉｎｍｏｒｄｅｍ、Ｖａｓｔｅｗ酣ｅｒｔｒｅ舭ｍｅｎｔ．Ｎｉ订ｉ＆越ｏｎ掣ｆ融豫艇ｂｙ舞彝ｆｙｉｎｇ卺鑫ｃ鼢ｉａ拓ａｋｅｙ笋∞ｅｓｓ识ｒｃｍ。
湛江湾沉积物中氨氧化微生物的丰度、多样性和分布特征
湛江湾沉积物中氨氧化微生物的丰度、多样性和分布特征阳雯娜;董宏坡;侯庆华;李雁群;陈法锦;周欣;毛铁墙【摘要】[Objective]To analyze the abundance and biodiversity of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxidizing bacteria (AOB) from sediments of Zhanjiang Bay.[Method]Molecular ecological approach was used. [Results]The number of AOA amoA ranged from 3.23×105to 5.27× 106copies·g-1(in dry deposit soil,the same below)while that of AOB amoA ranged from 2.99×104to 1.06×107copies·g-1. Their average abundance was almost equal. However, when only the subtidal zone was considered,the abundance of AOA amoA gene was higher than that of AOB amoA gene for most of sites. In combination with significant positive correlation between AOA amoA gene and ammonium concentration or total organic carbon, we speculated that AOA dominated the ammonia oxidation in subtidal zone of Zhanjiang Bay. The diversity of AOA in sites close to sewage outfalls of plants and aquaculture zone was higher that other sites, whereas the trend of AOB was opposite. It suggest that AOA had higher adaptive capacity for environments with pollutants than AOB. Phylogenetic analysis found that 88% of AOA amoA sequences were affiliated with Group I.1a of marine AOA cluster,and the dominants were a new clade of AOA. In subtidal zone, Nitrosospira was the dominant AOB while Nitrosomonas was the dominant AOB in intertidal zone. CCA analysis showed that community structures of AOA and AOB was significantly influenced by salinity and pH. [Conclusion]Distribution patterns ofammonia-oxidizing microorganisms in sediments of Zhanjiang Bay was closely correlated with several environmental factors including ammonium, total organic carbon, salinity and pH.%[目的]分析湛江湾沉积物中氨氧化古菌(AOA) 和氨氧化细菌 (AOB) 的丰度与多样性.[方法]采用分子生态学方法.[结果]AOA amoA基因丰度范围为3.23×105~5.27×106copies·g-1(以干土计),AOB amoA基因丰度范围为2.99×104~ 1.06×107copies·g-1(以干土计),两者平均丰度差别不大;但对于潮下带,大部分站位AOA amoA基因丰度高于AOB,且与氨氮和有机碳含量显著正相关.在工厂排污口和养殖区AOA多样性高于其他站位,而AOB 则相反,说明AOA对环境污染物有更强的适应能力.系统发育分析显示,88%的AOA amoA序列属于海洋簇Group I.1a,优势类群是一类喜热带气候的AOA新分支;潮下带亚硝化螺菌属AOB为优势种群,而潮间带亚硝化单胞菌属AOB为优势种群.CCA分析表明,盐度和pH显著影响湛江湾AOA与AOB的群落结构.[结论]湛江湾沉积物中氨氧化微生物的分布与氨氮、总有机碳、盐度、pH等多种环境因子密切相关.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2018(038)002【总页数】10页(P37-46)【关键词】氨氧化微生物;基因;amoA;丰度;多样性;分布;沉积物;湛江湾【作者】阳雯娜;董宏坡;侯庆华;李雁群;陈法锦;周欣;毛铁墙【作者单位】广东海洋大学食品科技学院;广东海洋大学海洋与气象学院,广东湛江524088;广东海洋大学海洋与气象学院,广东湛江 524088;广东海洋大学海洋与气象学院,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院;广东海洋大学海洋与气象学院,广东湛江 524088;广东海洋大学海洋与气象学院,广东湛江 524088;广东海洋大学海洋与气象学院,广东湛江 524088【正文语种】中文【中图分类】X172;Q938.1氨氧化是硝化过程的限速步骤，通过与反硝化过程的耦合，可清除河口或海湾10% ~ 80%的人类活动产生的氮污染，减轻水体的富营养化[1]。
西藏米拉山土壤古菌16SrRNA及amoA基因多样性分析
Research Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(8):994-1002;4August 2009ISSN 0001-6209;CN 11-1995 Q http: actamicrocn基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2009CB119000);公益性行业(农业)科研专项经费项目(NYHYZX07 050)*通信作者。
Tel Fax:+86 10 82109545;E mail:xiebingyan2003@作者简介:孟祥伟(1981-),女,籍贯,硕士研究生,研究方向为土壤微生物分子生态。
E mail:xiaowei031@163 c om 收稿日期:2009 03 23;修回日期:2009 04 27西藏米拉山土壤古菌16S rRNA 及amoA 基因多样性分析孟祥伟,茆振川,陈国华,杨宇红,谢丙炎*(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)摘要: 目的 本研究旨在了解西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌及氨氧化古菌群落结构组成情况。
方法 采用未培养技术直接从土壤中提取微生物总DNA,分别利用通用引物构建古菌16S rRNA 基因和氨氧化古菌a moA 基因克隆文库。
利用DOTUR 软件将古菌和氨氧化古菌序列按照相似性97%的标准分成若干个可操作分类单元(OTUs)。
结果 通过构建系统发育树,表明古菌16S rRNA 基因克隆文库包括泉古菌门和未分类的古菌两大类,并且所有泉古菌均属于热变形菌纲。
氨氧化古菌amoA 基因克隆文库中序列均为泉古菌。
古菌16S rRNA 基因和古菌amoA 基因克隆文库分别包括64个OTUs 和75个OTUs 。
结论 西藏米拉山高寒草甸土壤中古菌多样性比较丰富,表明古菌在高寒草甸土壤的氮循环中可能具有重要的作用。
关键词:古菌;16S rRNA 基因;amoA 基因;系统发育分析中图分类号:Q939 文献标识码:A 文章编号:0001 6209(2009)08 0994 09 古菌作为三域之一的生物[1],具有其独特的性质,也是目前生物地球化学研究的热点之一。
古菌氨氧化与amoA基因的扩增
古菌氨氧化与amoA基因的扩增蒋敏芝;黄秋雨【摘要】Ammonia oxidation is a obligate aerobic： chemoautotrophic process taken by a small part bacterial community of Hymenomycetes. Ammonia-oxidizing bacteria （AOB） is a inorganic： autntrophic micro-organism, responsible for converting NH4＋ to NO2- in the nitrification reaction, ammonia oxidizing archaea （AOA） is independent of the AOB clade. The paper introduced discovery and ammonia oxidation of AOA, extracted, purified and amplified amoA genes according to its features.The results confirmed exist of AOA, and provided basis for follow-up study.%氨氧化过程是由变形菌纲中的一小部分细菌类群所进行的专性好氧的化能自养过程,氨氧化细菌（AOB）是硝化反应中负责将NH4＋转化为NO2-的一类无机自养微生物,氨氧化古菌（AOA）是独立于AOB进化枝之外的能进行氨氧化作用的古菌。
介绍了AOA古菌的发现过程及其氨氧化作用,提取、纯化了amoA基因并利用amoA基因的特征,对它进行扩增,证实了AOA古菌的存在,并为后续研究提供了依据。
【期刊名称】《上海化工》【年(卷),期】2012(037)006【总页数】5页(P5-9)【关键词】氨氧化古细菌;amoA基因;PCR扩增【作者】蒋敏芝;黄秋雨【作者单位】华东师范大学上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室,上海200062;华东师范大学上海市城市化生态过程与生态恢复重点实验室,上海200062【正文语种】中文【中图分类】X11 氨氧化古菌的发现过程多年来,科学家们一直认为地球上生命由原核生物和真核生物两大类组成，到20世纪70年代，这个概念受到了Woese研究的挑战。
东湖表层沉积物中氨氧化古菌和氨氧化细菌丰度及多样性研究
东湖表层沉积物中氨氧化古菌和氨氧化细菌丰度及多样性研究潘彦羽;代嫣然;王飞华;梁威【期刊名称】《水生生物学报》【年(卷),期】2018(042)002【摘要】研究通过高通量测序和荧光定量PCR等分子生物学分析方法,以氨单加氧酶基因(amoA)为分子标记,研究了东湖表层沉积物中AOA和AOB的群落多样性、丰度及其与环境因子的关系.结果表明, 东湖沉积物AOA主要为Nitrosopumilus,其群落结构与沉积物中总氮含量显著相关,而AOB主要为Nitrosomonas,群落结构与沉积物中总有机碳和总磷显著相关.此外, 不同季节AOA丰度均高于AOB, 且沉积物AOA数量与温度呈显著负相关, 但AOB丰度变化不明显.东湖沉积物中AOA可能主导了氨氧化过程.%Ammonia oxidation is the rate-limiting step in nitrification. Ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammo-nia-oxidizing bacteria (AOB) play important roles in ammonia oxidation. Sediments are important place for nitrogen circulation in lake. This study investigated the community diversity and abundance of AOA and AOB in the surface sediments of Donghu Lake and their relationships with environmental factors utilizing high-throughput sequencing and real-time quantitative PCR of ammonia monooxygenase(amoA)gene.The results showed that AOA and AOB were dominated by Nitrosopumilus andNitrosomonas,respectively.There were significant correlations between the com-munity structure of AOA and total nitrogen (TN) in sediments. AOB were significantly related to the contents of total organic carbon (TOC) andtotal phosphorus (TP). Additionally, AOA abundance was higher than that of AOB in the sediments. A significantly negative correlation between AOA abundance and temperature was detected, but there was no obvious change of AOB among the different seasons. These results implied that AOA could be the dominant driver in the ammonia oxidation in Donghu Lake.【总页数】10页(P406-415)【作者】潘彦羽;代嫣然;王飞华;梁威【作者单位】中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072;中国科学院大学, 北京 100049;中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072;中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072;中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072【正文语种】中文【中图分类】Q938.1+5【相关文献】1.典型生境中氨氧化古菌和厌氧氨氧化细菌的分布和丰度 [J], 徐相龙;陈祥春;刘国华;范强;王皓;任争光;齐鲁;王洪臣2.蓝藻水华消亡对湖泊表层沉积物中氨氧化细菌丰度和群落结构的影响 [J], 黄睿;沈烽;罗娟;王司辰;唐启彤;徐慧敏;吴燕;赵大勇3.湛江湾沉积物中反硝化和厌氧氨氧化细菌的丰度、多样性及分布特征 [J], 毛铁墙; 董宏坡; 陈法锦; 侯庆华; 朱庆梅; 阳雯娜; 张家伟; 纪梓晗; 凌炜琪4.南海北部陆坡表层沉积物氨氧化古菌多样性初探 [J], 刘国辉;吴后波5.氨氧化细菌和氨氧化古菌在百花湖沉积物中的垂直分布 [J], 梁龙;梁小兵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
群独 特 的微 生 物吸 引 了人 们 的 目光 ，成 为一 个新 的
研 究热 点【。 切 本 实 验 对 崇 明湿 地 土 壤 古 细 菌 总 Ｄ Ａ进 行 提 Ｎ
还原 过程 ，主要 由兼性 异养 菌在 无分 子 态氧 的条 件
２ ０ 的 实 验研 究 发 现海 洋 氨 氧化 古 菌 具 有 ０ ９年 极 低 的 Ｋ 值 （． ３￣ ｏ Ｌ ， 海 洋 原 位 氨 氧 化 ｍ ０１ ｍ ｌ ）与 ３ ／ 动力学 规律 基本 吻合 ，暗示 泉古 菌在 海洋 氨 氧化 中
小 部分 细菌 类群 所进 行 的专性 好氧 的化 能 自养 过
固氮 作用 由多 种细 菌参 与，它们 利用 固氮酶 ， 结
合其它的酶和辅酶， 消耗能量， 打开氮气分子的三键 ， 转化为可直接被生物体利用的有效氮。 固氮作用是海 洋氮素的主要来源［ 在整个氮素循环中最为重要 。 ９ １ ， 硝化 作用 是全 球氮 循环 中的一个 关键 过 程 。在
第３ ７卷
过 去几 年 ， 环途径 被 先后更 新 了 ２次 ， 氮循 分别
内生理 『和野 外生 态学 ｆ的实 验证 实 了 Ａ Ａ 的氨 氧 ｌ １ ］ ｌ ４ １ Ｏ
由于 自然界 中厌氧氨氧化菌（ ａ ｏ ） Ａｎｍｍ ｘ和氨氧化古
菌 （ Ｏ Ａｍ ｎ ０ｉａｉ ｒｈｅ ） 的 发 现 。 此 Ａ Ａ， ｍ０ｉ ｄｔ ｎ ａｃａａ￣ ０ 外 ，异 养 硝化在 氮循 环 中 的作 用也 引起 了一些 学 者
反 硝 化 是 把 Ｎ ，或 Ｎ ￣转 化 为 Ｎ Ｏ或 Ｎ Ｏ一 Ｏ 的
性步骤的关键酶［，ｍ Ａ即编码氨单加氧酶活性位 【ａ ｏ ２ ｌ 点多肽 上 的基 因 。近年来 ， 些 国外 学者 为研 究环 境 一 样 品中氨氧化菌 的种群特征和系统发育状况 ，利用 ａ ｏ 因作为标记从分子水平上进行探究 。 ｍ Ａ基 随着越
程【。 １ 传统的硝化反应涉及到 ２种微生物 ， 】 ］ 即亚硝酸
氧化 菌 （ Ｏ ，Ｎｔｔ ０ｉａ０ ｂｃ ｒ ） 氧化 菌 Ｎ Ｂ ｉｉ ｄｔ ａｔ ｉ 和氨 ｒｅ ｉ ｅ０ （ Ｏ ， ｌ ｎａ ｏｉａｉ ａｔ ｉ）它们 均 为 自养 Ａ Ｂ Ａｍｌ ｉ ｘｄｔｎ ｂｃｅ ａ ， ｌ ￣ ｏ ｒ 菌 。 氧化 过程 中主 要 由 ２种 酶参 与 ， 为羟胺 氧 氨 分别
发挥了重要作用 。
３ Ａ ＯＡ 的 ａ Ａ基 因提 取 与 纯 化 ｍｏ
ａ ｏ是 氨氮 氧化 成亚 硝 酸盐 的硝 化 作 用 中 限制 ｍ
化酶 （ Ｏ ｙｒｘｌｍｉ ｘｄｓ ）和氨单加氧酶 ＨＡ ，ｈｄｏｙａ ｎ ｏｉａｅ ｅ （ ＭＯ ｌＤ ｎａｍｏｏｘｇｎｓ ） 硝 酸氧 化过 程 Ａ ，ａ ｌ ｉ ｎｏｙｅａｅ ；亚 ｎ￣ 由亚 硝酸 氧化 还原 酶 （ Ｏ ，ｎｔｔ ｏｉｏｅｕｔ ｅ Ｎ Ｒ ｉｉ ｘ ｒ ｃａ ） ｒｅ ｄ ｄ ｓ 催化 。此外 ，有机或无机氮还能被异养硝化菌所氧 化， 异养 硝 化 微生 物 包 括 细菌 、 线菌 、 放 真菌 以及 藻 类等 。
好 氧条件 下 将 Ｎ ４经 Ｎ 氧 化为 Ｎ ， Ｈ＋ Ｏ一 Ｏ一 。该过 程 在
１９ ０年被 Ｗｉｏｒｄｋ 首 次发 现［。 ８ ｎ ｇａ ｓｙ 】 ０ １ 典 型氨 氧化过 程被 认为 是一 个 由变形 菌 纲 中 的
一
氨氧化过程提供了大约一半的亚硝酸盐 。在太平洋 上 中层海域中，绝大多数泉古菌都具有铵态氮氧化 的代谢机制， Ａ Ａ是海洋氮素循环非常活跃的 这些 Ｏ 环 。 Ｏ、
２２ Ａ ． ＯＡ 的氨 氧化作 用
最近 ， 基 因组学 ［ 常温 型古 菌分 离培 养 方 环境 ４ １ 和
面ｌ的进 展 首次 揭示 了常温 型 泉古 菌 （ ｓｐ ｉｃ １ ｌ １ ｏｈｌ ｉ ｃｅａｃａｏ ） ｒｎｒｈｅｔ 中的一个功能类群——Ａ Ａ， ａ Ｏ 为人们 认识常温型古菌的生态功能提供 了新 的视野。
下来 完成 。
氨化 作用 是微 生物 将有 机氮 化物 分解 生成 氨或
取， 并以纯化 Ｄ Ａ作为模板进行了 Ｐ Ｒ的扩增。 Ｎ Ｃ ３１ Ａ ． ＯＡ 的 ａ Ａ基 因提 取方 法 ｍｏ
铵的过程 ， 是海洋再生生产力的重要物质基础。 ３１１ 试剂 ．． 厌 氧 氨氧 化 Ａ ａ ｍｏ， ｎｅｏｉ ａ ｏｉ ｘ ｎｍ ｘＡ ａｒｂｃ ｍｍ ｎａ ｏ— （ ） Ｄ Ａ 提 取 缓 冲 液 ：０ ｏ ｒ — Ｃ １ Ｎ １０ ｍｍ ｌ ｉ Ｈ Ｉ Ｔ ｓ ｉ ｔｎ ｄ ｉ ）是 指 在 厌 氧 条 件 下 Ｎ ４与 Ｎ ２经 Ａｎ 一 ａｏ Ｈ＋ Ｏ－ （ Ｈ ８０ ，０ ｍｏ Ｅ Ｔ ｐ ８ ） １ ０ｍ ｌ 酸 姗 ｐ ＝ ．） １０ｍ ｌ Ｄ Ａ（Ｈ＝ ． ； ０ ｍｏ 磷 ０ 菌 作用 生成 Ｎ 的过 程［。 １ ３ 】 钠 （ Ｈ ８０ ；． ｍｍｏ ａ １ ％十 六 烷基 三 甲基 溴 ｐ ＝ ．） １ ］Ｎ Ｃ ，１ ５ 除这 些 生物 过程 外 ， 有 一些 非 生 物过 程 ， 括 化 铵 （ Ｔ Ｂ） 还 包 ＣＡ ； 海底 热 液 口中 Ｎ 生 成 氨 、 烧 时 Ｎ 氧化 成 Ｎ ３和 。 燃 ： Ｏ－ （ ）磷酸盐缓冲液 （Ｂ ） ： ａ １８ ； Ｃ ． ２ Ｐ Ｓ １ Ｎ Ｃ Ｋ １０２ Ｌ ｇ
的关 注㈣ 。
化功能 ，纯培养研究则清楚证实了泉古菌的氨氧化 潜力。 ２０ ０ ６年 Ｗｕ ｈｅ 等 『对北 海沿 岸 海水 进 行 连续 ｃｔｒ ｌ ５ ］ １ ２个月的监测发现， 泉古菌 ａ ｏ 因数量与海水 ｍ Ａ基 中铵态 氮浓 度呈 显著 负相关 关 系 。
２０ ０ ７年 ，ａ Ｌｍ等 【研究 发现 Ａ Ａ 为黑海 中厌 氧 ｔ ６ １ Ｏ