脂肪酸的β一氧化作用—酮体的生成及测定

脂肪酸的β一氧化作用—酮体的生成及测定

徐云剑

一、实验目的：

1．了解脂肪酸的β一氧化作用

2 . 过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量； 3. 掌握测定β一氧化作用的方法及其原理。

二、实验原理：

在肝脏内脂肪酸经 β一氧化的作用生成乙酰辅酶A ，两分子的乙酰辅酶A 可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成 β一羟丁酸。 乙酰乙酸，β一羟丁酸和丙酮总称为酮体。肝脏不能利用酮体，必须经血液运至肝外组织特别是肌肉和肾脏，再转变为乙酰辅酶A 而被氧化利用。酮体作为有机体代谢的中间产物，在正常的情况下，其产量甚微，患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。其反应历程如下：

CH 3 | CH 2

| CH 2 |

COOH （丁酸）

CH 3 | CH

‖ CH |

COOH （丁烯酸） CH 3 |

CHOH

| CH 2 | COOH

（β-羟基酸） CH 3 | C=O —→ | CH 2 | COOH

（乙酰乙酸）

脱羧

2乙酰辅酶A

CH 3COCH 3 （丙酮）

本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应滴定。在碱性条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：

2HaOH+I 2===NaOI+NaI+H 2O

CH 3COCH 3+3NaOI===CHI 3+CH 3COONa+2NaOH

剩余的碘可用标准Na2S2O3滴定

NaOI+NaI+2HCl===I 2+2NaCl+H 2O I 2+2Na 2S 2O 3===Na 2S 4O 6+2NaI

根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。

22H H -+−−−→←−−−2H -−−−→HOH

−−−→

三、实验材料、试剂和仪器：

（一）实验材料

家兔（或鸡或大鼠）的新鲜肝脏

（二）实验仪器

1、匀浆机

2、剪刀、镊子、漏斗

3、50毫升锥形瓶3个

4、碘量瓶4个

5、试管若干及试管架

6、5毫升微量滴定管

7、玻璃皿

8、恒温水浴锅

9、电子天平

（三）实验试剂

1．0.1%淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）

2．0.9%氯化钠溶液

3．0.5mol/L正丁酸溶液：

取4.5毫升正丁酸，用1N氢氧化钠溶液中和至pH=7.6,并稀释至100毫升。

4．15氯乙酸溶液

5．10%氢氧化钠溶液

6．10%盐酸

7．0.1mol/L液：

称取 12.7克碘和约25克碘化钾溶于水中，稀释到100毫升，混匀，用标准硫代硫酸钠溶液标定。

8. 0.1mol/L碘酸钾溶液：

准确称取碘酸钾3.249克，溶于水后，倒入1000mL容量瓶内，加蒸馏水至刻度线。

9．1/15mol/L磷酸盐缓冲液(PH=7.6)：

1/15mol/L酸氢二钠86.8毫升与1/15mol/L磷酸二氢钠13.2毫升混合。

10. 标准0.04mol/L硫代硫酸钠溶液：

称取无水硫代硫酸钠24.82克和无水硫酸钠400克，溶于1000mL刚煮沸而冷却的蒸馏水中，配成0.2mol/L的溶液，用0.1mol/L碘酸钾标定。

硫代硫酸钠溶液的标定：

吸取0.1mol/L碘酸钾20毫升于锥形瓶中，加入碘化钾1克及12mol/L 硫酸溶液5mL，然后用上述0.2mol/L硫代硫酸钠溶液滴至浅黄色，再加入0.1%淀粉溶液3滴作指示剂，此时溶液呈蓝色，继续滴定至蓝色消退为止，计算硫代硫酸钠溶液的准确浓度。临时将已标定的硫代硫酸钠溶液稀释成0.04mol/L。四、实验操作步骤

（一）肝匀浆的制备

将鸡颈部放血处死，取出肝脏。用0.9%NaCl溶液洗去表面的污血后，用滤纸吸去表面溶液，称取肝组织5g 置于玻璃皿上，倒入匀浆机中，搅碎成肝匀浆。再加入0.9%NaCl溶液，使肝匀浆总体积达10ml。

（二）酮体的生成

（三）酮体的测定

加完试剂后摇匀，放置10min。再向各碘量瓶中滴加10%HCl溶液2—5ml，使各瓶溶液中和至中性或微酸性。然后用0.02mol/L Na2S2O3滴定至碘量瓶中溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数滴0.1%淀粉溶液2-3滴作为指示剂，使瓶中溶液呈蓝色。并用0.04mol/L Na2S2O3 继续滴定至碘量瓶中溶液的蓝色恰好刚刚消褪为止。记下滴定时所用去的Na2S2O3溶液的毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量。

（四）理论计算

实验中所用肝匀浆中生成的丙酮量(mmol)=(A—B)×C×1/6

式中：A为滴1号样品所消耗的0.04mol/L Na2S2O3溶液的毫升数；

B为滴定2号样品所消耗的0.04mol/L Na2S2O3溶液的毫升数；

C 为Na2S2O3的浓度（mol/L）。

五、注意事项

1、在低温下制备新鲜的肝糜，以保证酶的活性。

2、加HCl溶液后即有I2析出，I2会升华，所以要尽快进行滴定，滴定的速度是前快后慢，当溶液变浅黄色后，加入指示剂就要慢慢一滴一滴的滴。

3、滴定时淀粉指示剂不能太早加入，只有当被滴定液变浅黄色时加入最好，否则将影响终点的观察和滴点结果。

六、实验报告

保留实验的有效数据，计算结果并分析讨论。

七、思考题

1. 为什幺说做好本实验的关键是制备新鲜的肝糜？

2. 什幺叫酮体？为什么正常代谢时产生的酮体量很少？在什幺情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体？

3. 为什么测定碘仿反应中剩余的碘可以计算出样品中丙酮的含量？

4. 实验中三氯乙酸起什幺作用？