GFP实验报告

绿色荧光蛋白的克隆

摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。

关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组

The cloning of green fluorescent protein

Abstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.

Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination

随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。

重组DNA技术又称分子克隆或DNA克隆技术，是将体外的目的DNA片段与载体连接，形成重组DNA分子，进而通过转化宿主菌（受体细胞）在其中复制、扩增，经筛选、鉴定获得单一DNA分子的大量拷贝（即克隆）。

基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、

黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP)是238 个氨基酸组成的单体蛋白，其分子量为27 kDa。GFP 作为一种新的报告基因，与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。采用基因工程手段生产GFP 标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术。

研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。

1．材料与方法

1.1目的基因与克隆菌

绿色荧光蛋白基因取自质粒pEGFP-N1,

克隆菌为DH5α，含Rˉ（限制酶缺陷型），Mˉ（甲基化修饰缺陷型），Ampˉ（氨苄青霉素）等筛选基因。

1.2载体，试剂

PMD18-T Vector连接试剂盒,质粒提取试剂盒（BioEASY）,Premix Taq,LB固体平板（含Amp、X-gal、IPTG）,两种限制性内切酶HindⅢ，EcoRⅠ

1.3引物

F——GGCAT ATGGTGAGCAAGGGCGA

R——CGGGATCC CTTGTACAGCTCGTC

1.4绿色荧光蛋白基因扩增

先按照质粒提取试剂盒的操作要求提取含绿色荧光蛋白的质粒，并电泳分析。将提取的质粒DNA(pEGFP-N1)2μl与1μl引物GFP1,1μl引物GFP2,6μl H2O及10μl Premix Taq 混匀，PCR反应条件如下：94℃预变性5min后，30℃个循环（94℃30s，56℃30s，72℃1min），72℃7min。电泳分析。

1.5重组DNA的转化

将上述扩增产物即绿色荧光蛋白基因片段与PMD18-T Vector连接（按照PMD18-T Vector连接试剂盒试用说明操作）。取10μl连接产物与100μl 感受态细胞混匀冰浴30min，再42℃水浴90℃，冰浴1～2min，加入800μl LB培养液，37℃振荡培养45min，取适量体积的转化细胞均匀涂布到含有Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，室温放置几分钟，倒置平皿37℃培养过夜。

1.6重组DNA筛选及鉴定

在酒精灯附近，从LB平板上挑选白色菌落，接种于4mlLB/Amp+培养液中，37℃振荡过夜。从扩大培养的菌液中提取重组质粒DNA，用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，电泳鉴定，设对照组为未经酶切的质粒。

2结果

2.1提取质粒DNA后电泳结果

如图1可见，我们的泳道在5000bp附近见明显亮带，说明我们成功提取到含目的基因的质粒。

M