体细胞核移植技术进展
体细胞克隆技术的最新进展
体细胞克隆技术的最新进展体细胞克隆技术是一项研究领域，目的是通过利用成年个体的不成熟细胞来复制一个完整的基因组。
这项技术曾经因为亚洲的一只羊而广为人知，这只羊的名字叫做“多莉”。
多莉羊是第一只通过体细胞克隆技术制造出来的动物。
自从多莉羊的诞生以来，体细胞克隆技术一直是科学界和公众关注的焦点之一。
不断的研究和实验已经使这项技术的很多问题得到了解决并进一步完善。
近年来，随着技术的不断进步，体细胞克隆技术也在不断发展和壮大。
体细胞克隆技术最新的进展之一是细胞核移植技术的改进。
细胞核移植技术是将一个成年体细胞的细胞核置入一个卵母细胞内，再通过特定的操作使细胞核与卵母细胞进行融合，并将其植入到一个代孕母亲的子宫内。
这种技术的成功关键在于细胞核。
细胞核包含了个体的遗传物质，如染色体和DNA的组成。
通过在特定环境下，将细胞核的组成逐渐调整为与卵母细胞相似，就可以使细胞核移植的过程更加稳定，从而提高成功的概率。
除了细胞核移植技术的改进之外，另一个广受关注的进展是基因修饰技术。
基因修饰技术是指利用生物技术手段来对基因进行修改或调整。
在体细胞克隆技术中，基因修饰技术可以被用来创造带有特定特征的动物，这些特征包括更高的生产力、更好的抗性、更长的寿命和更快的生长速度等。
通过利用基因修饰技术，可以创造出更加完美的生物品种，从而为农业和医学领域带来更多的可能性和不断进步的机会。
此外，体细胞克隆技术的另一个研究领域是干细胞研究。
干细胞是一种多能性细胞，它可以分化成一切身体组织。
通过在干细胞研究领域中探究细胞分化和再生的机理，科学家可以更好地理解细胞分化的规律。
在未来，干细胞技术将有望成为新的医学治疗方法，从而实现更加高效的治疗手段。
总的来说，体细胞克隆技术在医学和农业领域中的应用前景十分广阔。
随着技术的不断进步和发展，我们相信这项技术将会有不断的突破和新的发展，为我们带来更多的惊喜和奇迹。
尽管这项技术也带来了一些道德和法律层面的争议，但我们相信，科学家们的不懈努力将会使这项技术得到更好的应用和更为严谨的规范，从而真正为人类的健康和福祉做出更多的贡献。
体细胞核移植技术及其在生殖医学中的应用
体细胞核移植技术及其在生殖医学中的应用体细胞核移植技术是近年来发展起来的一种生物技术，它常常被用于动物科学、植物学研究和医学领域。
在医学领域，它被广泛应用于生殖医学，成为不孕不育夫妇所期待的一种治疗方式。
本文将深入探讨体细胞核移植技术在生殖医学中的应用。
一、体细胞核移植技术的定义和原理体细胞核移植技术是一种将成熟细胞的细胞核移植到另一个细胞中的技术，从而产生一个新的生命个体。
其实现方式是：首先将一个未受精卵子的细胞核去除，然后将成熟细胞中的细胞核移植到此无核卵子中，再让其发育成胚胎。
这样，成熟细胞的基因信息就传递到了一个新生命的细胞核中，这一新生的个体与基因捐献者具有相同的基因遗传信息。
二、体细胞核移植技术在生殖医学中的应用A.辅助生殖技术体细胞核移植技术在生殖医学中最基本的应用是辅助生殖技术（ART）。
对于那些无法自然怀孕的夫妇，体细胞核移植技术可以用于治疗不育症。
借助体细胞核移植技术，患者可以获取到一个基因与自己相同的新生命。
早在1997年，英国就出现了“达利”这样的克隆羊，当时便引起了全球热议，众多科学家开始探讨是否可以将这项技术应用到生殖医学中。
因此一些科学家尝试将这种技术用于辅助生殖。
早在2005年，科学家就对一名不育女性成功进行了羊的克隆，并用其所得的胚胎植入患者体内，结果患者成功怀孕并生下了健康的婴儿。
通过这种方法，科学家成功地治愈了一些无法怀孕的夫妇。
B.细胞治疗体细胞核移植技术可用于细胞治疗。
这种治疗方式主要依赖于移植的细胞类型，例如，神经细胞可以用于治疗帕金森病，干细胞可以用于治疗糖尿病等等。
同时，体细胞核移植技术还可以帮助患者治疗一些其他的疾病，例如，肝功能障碍、肺上皮微堵塞疾病等等。
可以看出，在临床上，这项技术也是一个非常有前途的方法。
C.生殖医学的发展众所周知，生殖医学的发展一直是面临挑战和阻碍的过程。
但是，有了体细胞核移植技术的应用，患者能够通过“基因亲缘”来获取新生命，这对很多没有望子成龙的夫妇来说，是一种很好的选择。
人类体细胞核移植研究进展
人类体细胞核移植研究进展近年来，体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer，SCNT）在生物医学领域引起广泛关注，是当前最受关注的前沿研究领域之一。
其理论基础是通过将一种细胞的细胞核移植到另一种细胞的细胞质中，重建一个新的细胞，使得这个新的细胞具备替代损失细胞或组织的能力。
依托这种技术，可以实现疾病的基因治疗、器官移植等医学目标。
本文将重点介绍人类体细胞核移植技术的基础科学、应用现状及未来发展方向。
一、基础科学SCNT技术最早应用于哺乳动物，成功实现了克隆绵羊多利等动物，并在现有的研究中被广泛应用于疾病的基因治疗和干细胞研究等方面。
人类体细胞核移植技术的研究始于上世纪90年代，最初是为了治疗不孕症而进行的实验，但由于涉及伦理、合法性等问题而受到限制，被迫暂停研究。
随着近些年伦理、法律等规范的相继制定，人类体细胞核移植技术又逐渐成为科学家关注的焦点。
人类细胞核移植过程主要包括以下几个步骤：首先，由取自患者的体细胞（如皮肤细胞）获得细胞核；接着，将得到的细胞核植入到去除了核的卵细胞中；最后，在细胞培养的过程中，使其进行分裂，形成一个新的细胞，具备可塑性等特性，这种新的细胞即为克隆细胞。
二、应用现状在临床领域，体细胞核移植技术被视为治愈亚细胞级缺陷和细胞失调疾病的希望。
例如，大约有1000多种遗传性疾病是由单个基因突变造成的，而体细胞核移植只需要用到几个取自病人的皮肤细胞，就可以创造出完整的几乎完全与病人等价的细胞，用于修复或替换病人体内受损的细胞。
在干细胞领域，SCNT技术还可以用于人体组织再生和器官移植等领域。
例如，可以利用组织工程学来开发人体组织的反应指标，如etRNA引导转录后翻译产物（tRNA-derived RNA），从而实现更快、更准确地协助组织移植；在器官移植等方面，SCNT技术可能会为超越器官移植领域内之物质问题和治疗限制带来新的方法。
三、未来发展方向虽然SCNT技术在理论和实际应用方面已有了很大的进步，但是与其它生物医学研究领域相比，仍存在许多挑战和困难，需要解决。
细胞核移植技术的应用和探索
细胞核移植技术的应用和探索随着现代科技的大力进步，细胞核移植技术也应运而生。
细胞核移植技术是指将一个植入体细胞的细胞核植入另一个受体细胞内，并使其重新获得一个全新的细胞机制。
这一技术的应用被广泛的探索和发掘，涵盖了许多领域。
今天，我们将围绕着这一主题，来探讨一下细胞核移植技术的应用和探索。
一、农业领域应用细胞核移植技术不仅在医学领域有着非常广泛的应用，也同样在农业领域中拥有光明的前景。
比如说，这项技术可以用于畜肉的改良。
以种牛为例，传统的培育方法需要经过多年的自然配对和繁殖，才能获得理想的肉牛品种。
但是，通过细胞核移植技术，我们可以在短时间内培育出高质量的肉牛品种。
在不断探索和研发的推动下，细胞核移植技术的应用在农业领域中也越来越受到重视。
二、外科手术治疗在外科手术治疗方面，细胞核移植技术也有着重要的应用。
研究显示，使用细胞核移植技术可以有效的修复或重建受伤或扭伤的关节或组织，缩短患者康复时间。
举个例子，关节炎常常会导致人的关节软骨受到磨损，甚至会出现变形。
而细胞核移植技术的应用可以有效的修复这些受损的关节软骨，让患者早日康复。
三、治疗遗传病细胞核移植技术可以用于早期干细胞的鉴定和分离，其应用比较广泛。
作为一种治疗遗传病的方法，细胞核移植技术将患者的遗传信息全部转移到健康细胞中，从而实现治疗效果。
而这一技术不仅可以创造健康细胞，还可以在干细胞的治疗过程中逐渐去除不正常的细胞。
在这一基础上，细胞核移植技术的应用在治疗遗传病时也具有较高的安全性和稳定性。
四、生殖医学应用细胞核移植技术在生殖领域的应用也受到研究者们的广泛关注。
特别是在不孕症或者体外受精孕育方面，细胞核移植技术被看作是一项颠覆性的技术，有着巨大的应用前景。
通过取出女性的卵母细胞，然后将其与男性提供的精子进行合并，将得到新的精子。
此外，细胞核移植技术还可以用于优生学研究、基因改良、借体分娩等多种生殖领域的研究和应用。
总结：细胞核移植技术的应用和探索具有广泛的前景和潜力。
浅析细胞核移植研究进展
浅析细胞核移植研究进展细胞核移植是一种重要的生物技术手段，通常被用于研究和治疗。
随着科学技术的不断发展，细胞核移植在不同领域都有着重要的应用和研究价值。
本文将从细胞核移植的原理、研究进展和未来发展方向等方面进行浅析，以便更好地了解这一重要技术的最新进展。
一、细胞核移植的原理细胞核移植是一种通过移植细胞核来改变细胞性状的技术手段。
其基本原理是将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞的质体中，从而使得质体内的细胞核被替换为新的细胞核。
这样一来，原来的细胞就获得了新的遗传信息，并且可以表现出与原来细胞不同的性状。
细胞核移植的原理看似简单，但实际操作却有着诸多挑战和难点。
如何准确地取出细胞核、如何将其植入到受体细胞中、如何确保细胞核的正常功能等都是需要解决的问题。
这些技术难题的解决，将为细胞核移植技术的进一步发展提供重要的支持。
细胞核移植技术最早是在20世纪50年代首次被成功应用于动物实验中。
当时，科学家们利用这一技术成功地克隆了多只动物，这标志着细胞核移植技术在动物克隆领域取得了重要突破。
随后，细胞核移植技术被应用于植物领域，比如利用细胞核移植来繁殖珍稀植物、改良作物品种等。
这些研究成果为细胞核移植技术在农业生产和环境保护等方面的应用提供了强大的支撑。
除了动植物领域，细胞核移植技术在医学领域也有着广泛的应用。
将患者成熟细胞中的健康细胞核移植到受体体细胞中，从而修复受体的受损细胞功能；或者，利用细胞核移植技术来研究疾病的发生机制，为疾病的治疗提供新的思路和方法。
这些研究成果为细胞核移植技术在医学领域的应用提供了宝贵的经验和成果。
随着科学技术的不断发展，细胞核移植技术也在不断取得新的进展。
利用基因编辑技术可以将特定基因导入到供体细胞中，从而使得受体细胞获得新的遗传信息；或者，利用生物材料工程技术可以改善细胞核移植的操作流程，提高移植成功率。
这些新的技术手段和方法为细胞核移植技术的进一步发展提供了重要的支撑和保障。
体细胞核移植技术的研究进展
体细胞核移植技术的研究进展张鹏【摘要】体细胞核移植这是近年来人类在细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一,他的成功表明动物体细胞的分化是可逆的.然而体细胞核移植的基础理论以及技术研究目前还有很多薄弱点,存在着克隆成功率较低等问题,在一定程度上限制了它的发展.本研究根据近年体细胞核移植技术的研究情况,对应用这项技术进行克隆的主要步骤、该技术在生物学、医学等领域的应用前景以及目前仍需克服的一些问题作一综述.【期刊名称】《中国医药科学》【年(卷),期】2016(006)005【总页数】4页(P40-43)【关键词】体细胞;核移植;克隆;表观遗传重构【作者】张鹏【作者单位】西安医学院外科学教研室,陕西西安 710021【正文语种】中文【中图分类】Q819一直以来研究人员普遍认为只有通过卵子和精子相互结合形成受精卵，随着受精卵的不断分化，最终才能发育成为一个新的生命，但在这个过程中，受精卵细胞同时也将逐渐地失去其发育成为完整后代的能力，把受精卵细胞具备发育成为完整个体的能力称为全能性。
体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术的成功归因于人们对细胞全能性的逐步认识。
核移植（NT）就是将动物的体细胞或者早期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育成熟的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后通过重新激活，恢复其细胞分裂及分化，从而促使其发育成为与供体细胞的基因型完全相同的子代，这一技术也可称为体细胞克隆技术。
体细胞核移植技术最早是由德国的胚胎学家Spemann 1938年提出的，他起初提出这个理论，主要是为了研究细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的过程中细胞质与细胞核的相互作用机理。
直到1952年Briggs和King按照他的理论，首次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其中移植进其囊胚细胞核，从而得到了正常的后代[1]。
人类体细胞克隆技术的现状
人类体细胞克隆技术的现状在科幻小说中，克隆技术早已经被广泛的应用，但是在现实中，克隆技术却还停留在实验室层面。
然而，人类体细胞克隆技术已经在不断的发展中，并取得了一些重要进展。
本文将重点探讨人类体细胞克隆技术的现状。
一、什么是人类体细胞克隆技术人类体细胞克隆技术是指利用人类体细胞的核移植技术将一个成年人的细胞核移植到一枚没有发育成胎儿的卵细胞内，从而使新细胞原型具有与该成年人完全一样的基因组。
这个被克隆的细胞会发展成一个与原本体细胞相同的个体，这就是克隆。
二、人类体细胞克隆技术的发展历程人类体细胞克隆技术的发展可以追溯到上世纪90年代，当时，科学家们在组织培养皿中成功地将一只羊的细胞克隆成了另一只羊，这就是闻名世界的多利克隆羊事件。
此后，随着科技的不断进步，人类细胞克隆技术也在不断完善。
2002年，世界上第一只克隆人“多莉”出现在了公众的视野中。
当时，克隆人的出现引起了巨大的轰动，也引起了全球科学家的关注。
不过，多莉的健康情况令人担忧，她在各种疾病中比正常克隆的羊更易感。
三、目前，虽然人类体细胞克隆技术已经有了一些重要的进展，但总体来说，它仍然处于实验室阶段，离实际应用还有很长的路要走。
1、以卵母细胞为基础的克隆技术现在，以卵母细胞为基础的克隆技术已经相对成熟。
研究人员使用特殊的方法将卵母细胞的核移植到另一个卵母细胞中，然后对其进行激活，使其开始分裂。
在分裂过程中，研究人员选择了一个细胞，从而制备出了克隆胚胎。
2、嵌合胚胎法嵌合胚胎法是将两个胚胎拼接在一起，形成一个含有两种胚胎的单一实体。
这种技术还处于实验室阶段，但有很大潜力用于生殖医学和疾病治疗。
3、SCNT技术同源移植核方法（SCNT）是一种将个体细胞核移植到卵子中的技术。
目前已经在实验室中成功地用于制作人类胚胎干细胞（hESC）。
四、人类体细胞克隆技术的前景人类体细胞克隆技术的前景非常广阔，它可以被用于改善生育或用于治疗疾病。
以下是它的一些可能应用领域：1、存储器官人体器官可以被重构，为那些需要器官治疗的病人提供帮助。
体细胞克隆技术及其在动物育种中的应用
体细胞克隆技术及其在动物育种中的应用体细胞克隆技术是一种利用不同的细胞核移植来实现动物繁殖的先进技术。
这种技术很早就已经出现了，在过去十多年里经过不断的改进和发展，现如今已经被广泛应用于各个领域，其中包括动物育种产业。
本文将重点探讨这种技术的原理、进展和应用。
一、体细胞克隆技术的原理体细胞克隆技术是一种以非传统方式进行动物繁殖的技术，其原理主要是利用体细胞核移植的方法来实现。
这种技术基本上是将一个成熟动物的体细胞核提取出来，然后将其植入到另一个没有核的卵细胞中，通过不同的方式将植入的细胞核再次激活，从而使得卵细胞具备生殖能力。
具体来说，体细胞克隆技术通常包含以下几个步骤：首先，提取需要克隆的动物体细胞中的细胞核，并进行一定的处理，以便让细胞核能够被卵细胞所接受。
其次，从同种或者不同种动物中提取一个未受精卵细胞，然后将被处理过的细胞核植入到其中。
接着，使用一种特殊的电流刺激方式来帮助细胞核与卵细胞合并并且激活卵细胞。
最后，将成功激活的卵细胞植入到一只代孕母畜的阴道内，，等待其正常发育和出生。
二、体细胞克隆技术的进展体细胞克隆技术的历史可以追溯到上世纪 50 年代，在当时的科学家们的不断尝试和研究下，这种技术逐渐开始逐步成熟。
其中最为著名的例子就是在 1996 年成功对一个名为 Dolly 的羊进行的细胞克隆实验。
这项实验被认为是人类历史上的一个里程碑，也为这个技术在未来的发展和应用奠定了基础。
近些年来，体细胞克隆技术在各个领域中有了越来越广泛的应用。
除了在动物育种中的应用之外，体细胞克隆技术还被广泛应用于医学领域、夺回保护动物及其栖息地等大熊猫和贵州平头蛇的研究中等。
而随着技术的不断进步和新理论的不断出现，这种技术也在不断发展，成为了一种具有深远影响的科技创新。
三、体细胞克隆技术在动物育种中的应用体细胞克隆技术在动物育种方面的应用主要包括三种方向。
首先，这种技术可以用于产生更为优良的品种或者基因型。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270490),重庆市科技计划项目(7452)作者单位:400037 重庆,第三军医大学新桥医院神经内科[周竹娟 郑 健(通讯作者)]体细胞核移植技术进展周竹娟(综述) 郑 健(审校)中图分类号 Q 23 文献标识码 A 文章编号 1007-0478(2008)04-0251-03转基因动物的研究和生产是动物胚胎工程中最诱人和最有发展前景的课题之一。
早期用受精卵原核内注射外源基因和利用精子作为载体将外源基因导入受精卵的方法,其缺点是整合效率低,而且很难实现定点整合,出生的转基因动物外源性基因的表达也不稳定[1]。
著名的多丽羊的诞生使体细胞核移植技术成为一种新的生产转基因动物的方法。
核移植(nuclear transfer,N T )通常是指将外源性细胞核作为供体转入到去核卵母细胞中,细胞核发生基因程序重编获得多能性,开始新的胚胎发育。
细胞核移植能更为有效地对动物基因进行修改,是唯一可以用来生产大量相同基因型动物的方法[2,3]。
1997年前核移植的供体核主要来源于胚胎细胞,多丽羊的诞生表明成年体细胞核也可以作为核移植的供体核。
近年的研究将基因修饰与核移植技术相结合,通过质粒转染的方法将某基因整合到细胞核中,再将此类细胞筛选出来,把这些细胞核转入到去核卵母细胞中,建立重组胚,产生的胚胎中所有的细胞均携带这种基因,使其生物技术应用价值得到进一步提高[4]。
应用核移植技术比原核内注射更能有效转入和结合更大的(>100kb)DN A 片断,也有利于强化有利的等位基因和/或去除不利的等位基因[4]。
1 细胞去核的方法在核移植技术中细胞去核的方法有三种。
一是用机械方法去核。
常见机械去核方法有用显微操作仪将核吸出[5~7]或是用梯度离心的方法将细胞核和胞质体分开[8]。
近年又发展了改良的微操作法去核,且对去除透明带的卵母细胞进行微操作法去核较不去除透明带的传统微操作法去核成功率更高[7];二是用X 线照射的方法去核[9]。
有研究比较用显微操作仪去核的机械方法和用X 线照射的方法去核,重组胚发育到两细胞阶段、八细胞阶段、胚泡阶段的比例没有明显差异,但X 线照射可能产生其它意想不到的副作用,如减少了重组胚的发育潜能,可能与X 线去核引起D NA 诱变有关。
因此,尚需大规模实验来证实X 线去核法的安全性[9];三是应用秋水仙胺的化学方法去核。
有研究显示化学方法去核作用的起始时间和持续时间长短对去核率有很大影响,去核效率从3.4%~91.7%不等,用这种方法产生的去核卵母细胞可成功用于核移植[10~12]。
现也有研究将化学方法和机械方法去核相结合,用秋水仙胺处理卵母细胞,再去除卵丘细胞、消化部分透明带,用显微刀片对形成单极体的卵母细胞进行定向切开,从而获得胞质体;其去核效率较单用显微刀片机械去核效率高[13]。
2 核移植的方法目前用于细胞转核的方法有以下几种:(1)电融合法;(2)PEG 介导法;(3)微注射法。
2.1 电融合法 电诱导细胞融合是20世纪80年代发展起来的一项细胞工程技术。
它是使细胞在电场中极化成偶极子,并沿电力线排列成串,然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
该方法具有融合过程容易控制、融合效率高、无毒性、可重复性强、作用机制相对比较清楚等优点[14]。
进行电融合时融合槽中细胞悬液的细胞密度通常为105/ml,电介质电泳的交流电场振幅为10~30V /mm,频率为1~3M H z,在80%以上细胞形成串珠时加用10~50 s 的100~1000V/mm 的直流高压使细胞发生融合[15]。
电融合的参数如电融合的时间、脉冲强度、融合介质的平衡,都与胞质体和核来源细胞的物种有很大的相关性[4]。
核供体细胞来源相同时,电融合参数相近。
细胞融合效率随物种和细胞类型不同而不同[16,17]。
N agashima 等采用10 s 的200V/mm 的高压直流脉冲使猪胚胎成纤维细胞核与猪成熟去核卵母细胞胞质体中发生融合[2]。
Shin 等采用15 s 的175~185V/mm 的高压直流脉冲作为将成年牛耳成纤维细胞细胞核转入牛去核卵母细胞胞质体中的电融合条件[6]。
Das 等的研究显示将山羊胚胎成纤维细胞细胞核转入山羊去核卵母细胞胞质体中,给予20 s 的250V /mm 、300V/mm 和350V /mm 的直流脉冲可分别有7.7%、18.8%和33.3%的重组胚胎形成单侧切迹,10.2%、18.8%和16.7%的重组胚胎形成双侧切迹;给予5 s 的250V/mm 、300V/mm 和350V /mm 的直流脉冲可分别有12.5%、17.1%和8.3%的重组胚胎形成单侧切迹,25%、20%和16.7%的重组胚胎形成双侧切迹;给予10 s 的250V /mm 的直流脉冲有4.8%的重组胚发育到两细胞阶段;给予5 s 的300V/mm 的直流脉冲有8.3%的重组胚发育到两细胞阶段;给予10 s 的300V /mm 的直流脉冲有6.3%的重组胚胎发育到两细胞阶段。
从山羊胚胎成纤维细胞核与山羊去核卵母细胞胞质体融合后重组胚的形成和发育情况来看,用300V /mm 的直流脉冲进行融合较为理想[5]。
融合后需对重组胚进行激活,成功的激活能促进胚泡的发育,胚泡发育至一定阶段后才能植入合适的受体动物体251 卒中与神经疾病2008年8月第15卷第4期内[4]。
尽管电融合在转核的同时可以使重组胚胎发育激活,但应用更普遍的是采用离子载体和蛋白激酶抑制剂结合的化学激活方法[2,3]。
电融合后用蛋白酶抑制剂M G132处理重组胚可明显增加重组胚的发育潜能,胚泡形成率较对照组明显增加[18]。
有研究表明将成年牛耳成纤维细胞植入去核卵母细胞的卵黄周,然后进行电融合和化学激活;在电融合后4h,对重组胚进行化学激活,重组胚发育到胚泡和两细胞胚胎的比例比同时进行电融合和电激活或同时进行电融合和化学激活比例要高,这可能与电融合和后续的化学激活导致受体卵母细胞胞浆环境改变,有利于重组胚进行基因程序重排有关[6]。
M elican的研究显示将羊胚胎细胞核转入去核卵母细胞时,同时进行电融合和激活与电融合后再进行电激活相比,所得到重组胚的形成率和重组胚的卵裂率无明显差别[16]。
电融合可以一次性处理大量的细胞。
近年来发展起来的将微观流体和电融合技术相结合的方法,甚至可以同时进行多种细胞的融合,并对融合细胞进行分选,可以快速、有效地获得融合细胞的组合库[15]。
电融合唯一的缺点是需要有昂贵的特定的设备来完成。
2.2 聚乙二醇介导的细胞融合法 聚乙二醇(polyethylene glycol,P EG)介导的细胞融合是一种简单有效的方法。
它广泛用于生产体细胞杂交体和进行体细胞核移植,生产体细胞杂交体时将两种细胞悬液混合后离心沉淀,再将聚乙二醇加入到细胞团中诱导两种细胞发生融合[14]。
PEG介导的细胞融合可以在贴壁细胞之间、悬浮细胞之间、贴壁细胞和悬浮细胞之间进行,可以用整个细胞或含核微小细胞作为供体与受体细胞发生融合[19]。
PEG介导细胞融合的机制不清。
目前普遍认为PEG 能改变各类细胞的膜结构,使两细胞接触处质膜的脂类分子发生疏散和重组,由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用,使细胞发生融合[14]。
PEG介导的细胞融合法现多用于两种细胞的融合。
采用PEG的分子量由1000~6000不等,浓度多在50%左右,作用时间在50s至2~3min不等,可能与融合的细胞种类不同有关。
因PEG本身具有毒性,延长作用时间可能会导致细胞死亡增加[20]。
将PEG用于细胞转核实验的报道较少。
Do等成功应用PEG介导胚胎干细胞细胞核与神经干细胞融合,使神经干细胞中本来静止的O ct4基因出现表达[8]。
为提高转核效率,有学者将电融合技术与PEG介导法相结合,在将乳腺上皮细胞的核转入去核卵母细胞前,先用pH8.0的PEG/二甲亚砜(dimethy l sulphox ide,DM SO)对乳腺上皮细胞处理5min再进行电融合,转核效率可明显提高,且不会影响重组胚的发育[21]。
PEG诱导细胞融合的优点在于经济、操作简单易行、可一次对较大数量细胞进行操作,实验周期短,但PEG介导的细胞融合很难标准化。
细胞团的大小、形状,P EG加入细胞团后振摇的速度,加入PEG到除去PEG的时间间隔都可能影响实验结果。
2.3 显微注射法 借助显微操作仪将供体细胞核从供体细胞中分离出来,直接注射到去核卵母细胞的胞浆中,然后再用伊屋诺霉素和6-二甲基氨基嘌呤或6-4-二甲基氨基吡啶或亚胺环己酮对重组胚进行激活[22~24]。
比较电融合和传统微注射两种核移植方法,可以发现两种方法构建的重组胚胎发育情况有一定的差异。
Nag ashima 等研究发现电融合组正常卵裂速度和胚泡形成的速度明显高于微注射组(45.6%:32.1%,19.2%:5.4%,P<0.05),且电融合方法建立的重组胚可以发育成正常的无性生殖胚胎,而注射法建立的重组胚不能发育成正常的无性生殖胚胎[2]。
L achamn-K aplan等分别用微注射和电融合的方法将胚胎成纤维细胞核转入牛去核卵母细胞中去,前者有8%~16%的重组胚发育到胚泡阶段,但没有活的动物出生,而后者有22%的重组胚发育到胚泡阶段,有两只健康的小母牛出生[25]。
可见从重组胚的发育上来说,电融合方法优于传统的微注射法。
核移植和卵母细胞活化时间的协调是核移植成功的关键,因此近年出现改良的一步微注射法。
该方法在卵母细胞活化前(通常卵母细胞在离开输卵管60m in后会自动活化)将外源性有丝分裂细胞核注射到未激活的卵母细胞中,再用微操作仪去除减数分裂中期的卵母细胞核[26]。
Zho u等[27]比较了电融合法和一步微操作法,发现一步微操作法获得的重组胚发育到囊胚的比例比电融合法高,且囊胚的发育更为正常。
可见传统的微注射法可能因卵母细胞去核和核供体细胞去核分开进行,步骤多,时间长,核移植时卵母细胞已经活化,影响了核移植的成功率。
根据重组胚发育情况,不同核供体细胞优先选择的转核方法各不相同。
羊膜上皮细胞作为核供体细胞时用电融合方法建立的重组胚发育情况较好,而用胚胎成纤维细胞作核供体细胞时用一步微注射方法建立的重组胚发育情况更好[28]。
总之电融合和显微注射法各有利有弊。
电融合方法应用广泛,可靠性高,在转核的同时可以激活卵母细胞,供体细胞膜的状态会影响转核效率。
显微注射法技术难度大,不能同时激活受体卵母细胞,但其操作步骤较少,转核效率与供体细胞膜的状态无关[2]。
另外显微注射法每次处理细胞量也少于电融合法。
近年来为减少核移植时对细胞的破坏,又发展起来一种振动微注射的方法,也称压电微注射。