分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用
食品中乳酸菌的分离鉴定及功能研究
食品中乳酸菌的分离鉴定及功能研究近年来，随着人们健康意识的提高，对于食品中乳酸菌的分离鉴定及功能的研究逐渐受到关注。
乳酸菌是一类广泛存在于食品中的有益菌群，具有许多对人体有益的功效，其鉴定与功能研究对于食品质量的提升和人类健康至关重要。
首先，乳酸菌的分离鉴定是研究乳酸菌功能的基础。
在食品中分离鉴定乳酸菌，可以帮助我们了解不同种类、不同来源食品中乳酸菌的种类和数量。
常见的分离鉴定方法包括传统的培养分离方法、分子生物学方法和基因测序技术等。
其中，传统的培养分离方法是最常用的一种方法。
通过在不同的培养基上进行培养，分析菌落形态、生理和生化特性，可以初步鉴定出乳酸菌的种类。
而分子生物学方法则可通过引物对乳酸菌特异基因进行扩增和检测，进一步确定其种类。
基因测序技术则可以更加准确地鉴定不同乳酸菌的种类和亲缘关系，为进一步深入研究乳酸菌功能奠定基础。
其次，乳酸菌的功能研究主要包括保健、抗菌和抗氧化等方面。
乳酸菌具有胃肠道保健功能，可以维护肠道的健康平衡，促进食物的消化吸收，降低胃肠道疾病的风险。
此外，乳酸菌还具有抗菌作用，特别是对肠道中的有害菌起到抑制作用，有利于维持肠道菌群的稳定。
同时，乳酸菌还具有一定的抗氧化功能，可以清除自由基、减少氧化应激，保护人体细胞免受氧化损伤。
乳酸菌的功能主要通过其代谢产物来实现。
乳酸菌代谢产物包括乳酸、抗菌物质、挥发性化合物和细胞外多糖等。
其中，乳酸是乳酸菌最主要的代谢产物之一，可以维持肠道的酸碱平衡，抑制有害菌的生长。
抗菌物质则可以直接杀灭或抑制有害菌的生长。
挥发性化合物则赋予乳酸菌独特的风味和香气，为食品增色不少。
细胞外多糖则具有一定的黏附能力，有助于乳酸菌在肠道中生存和繁殖。
针对乳酸菌的功能研究还包括乳酸菌的应用。
乳酸菌可以被广泛应用于食品工业，通过发酵食品，不仅可以制造出更多种类的美味食品，还可以增加食品的营养价值和保质期。
此外，乳酸菌在医学领域也有着广泛的应用前景。
研究表明，乳酸菌在预防和治疗肠道疾病、免疫调节、降低胆固醇、抑制肿瘤等方面具有潜在疗效。
食品中乳酸细菌的筛选和鉴定
食品中乳酸细菌的筛选和鉴定食品是人类生活中不可或缺的一部分，而乳酸细菌则是食品产业中的重要组成部分。
乳酸细菌在食品加工过程中起着关键的作用，例如发酵乳制品、面包、啤酒等。
因此，筛选和鉴定食品中的乳酸细菌对于食品安全和质量的保障具有重要意义。
首先，筛选食品中的乳酸细菌应该从源头开始。
当我们选择原料时，应注意选择新鲜且有机的食材。
乳酸细菌通常存在于新鲜的奶制品、蔬菜和水果中。
因此，在生产过程中应该选择高质量的原料，以确保食品中含有丰富的乳酸细菌。
其次，对食品中的乳酸细菌进行鉴定也是非常重要的。
目前常用的方法有传统培养方法和分子生物学方法。
传统培养方法是通过将食品样品接种到乳酸菌富集培养基中，然后根据菌落形态和生理特性进行鉴定。
虽然该方法简单易行，但对于少数难以培养的乳酸细菌则无法准确鉴定。
分子生物学方法是近年来迅速发展的一种鉴定乳酸细菌的新方法。
这种方法基于对乳酸细菌基因组的分析，通过PCR、蛋白质电泳等技术手段来确定乳酸菌的种类和数量。
分子生物学方法具有快速、准确和高通量的特点，可以帮助我们更好地了解食品中乳酸细菌的情况。
此外，筛选合适的乳酸菌应具备以下特点。
首先，应具备较强的耐受性，能够在食品加工过程中存活和繁殖。
其次，应具备较好的产酸能力，确保食品发酵的质量和风味。
最后，应能够对食品中的有害细菌起到一定的抑制作用，从而保证食品的安全性。
乳酸细菌在食品发酵过程中起到的作用不仅仅是改善风味，还具有多种益处。
首先，乳酸细菌能够制造出多种有益物质，例如乳酸、对乳酸菌独有的多种抗菌物质等。
这些物质具有抗菌、抗氧化和免疫调节等作用，对人体健康有益。
其次，乳酸细菌可以帮助消化，改善肠道菌群的平衡，增加人体对营养的吸收。
此外，乳酸细菌还可以帮助降低肠道内有害菌的数量，提高人体的免疫力。
然而，在乳酸细菌的选择过程中也存在一些问题和挑战。
首先，不同种类的食品需要不同的菌株，因此我们需要根据具体产品的特点来选择适合的乳酸菌。
分子生物学技术在食品微生物检验中的应用探析
分子生物学技术在食品微生物检验中的应用探析近年来，食品安全问题成为社会关注的热点，食品微生物检验成为保障食品安全质量的重要手段之一。
传统的微生物检验方法存在一些缺点，如操作繁琐、时间长、灵敏度低等。
而分子生物学技术的应用使得食品微生物检验更加快速、准确、灵敏，成为食品安全监测的重要手段之一。
PCR技术是一种重要的分子生物学技术，可以对食品中的微生物进行快速鉴定。
PCR技术利用核酸特异性引物，通过酶切扩增的原理，能够将微生物的特定DNA序列放大，从而快速鉴定食品样品中是否存在某种微生物。
利用PCR技术，可以快速鉴定出食品中的致病菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等。
PCR技术还可以快速鉴定出食品中的转基因成分和病毒等。
测序技术是分子生物学技术中的重要手段之一，可以对食品中微生物的基因组进行全面解析。
传统的微生物鉴定方法往往只能鉴定出微生物的种类，而无法了解其详细的基因信息。
而测序技术可以对微生物的基因组进行全面测序，从而了解微生物的遗传特性和潜在致病基因。
利用测序技术，可以对食品样品中的微生物进行全面的基因分析，从而更好地了解食品中微生物的种类和数量，为食品安全监测提供了更全面的信息。
免疫学技术也是食品微生物检验中的重要手段之一。
传统的微生物鉴定方法中，往往利用抗原抗体反应来鉴定微生物的种类和数量。
而免疫学技术可以利用抗体特异性识别微生物的抗原，从而实现对微生物的快速鉴定。
免疫学技术可以将微生物的抗原与特定抗体结合，通过检测抗原抗体结合反应来确定微生物的种类和数量，从而快速、准确地鉴定食品中的微生物。
分子生物学技术在食品微生物检验中的应用已经取得了很多成果。
从快速鉴定食品中的致病菌到全面解析微生物的基因组，从利用抗原抗体反应快速鉴定微生物的种类和数量，分子生物学技术为食品安全监测提供了更快速、准确、灵敏的方法。
还需要进一步完善和优化这些技术的操作流程和准确性，以提高食品安全检测的效率和准确性。
分子生物学技术在乳酸菌鉴定中的应用
Ｋｅ ｒ ｓ ｍｏｅ ｕａ ｉｔｃ ｎ ｌｇ ，ａｔｃａ ｉ ａ ｔｒ ， ｌｓｉ ｃ ｔ ｎａ ｄｉｅ ｔｆ ａｉｎ ｙｗｏ ｄ ： ｌｃ ｌｒ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ ｌｃｉ ｃｄｂ ｃｅｉ ｃａ ｓｆ ａｉ ｎ ｎｉ ｃ ｔ ｂ ａ ｉ ｏ ｄ ｉ ｏ
乳 酸菌 是指 能从 葡萄 糖 （ 可利 用 的其 它糖 或 类） 发酵 产 生大量 乳酸 的一 群细微 生物 Ｌ。 酸菌 １ 乳 Ｊ 作 为 细菌 的一类 ，它 的鉴 定方 法与 细 菌 的鉴 定方 法很 类似 。总 的来 说可 以分 为常规 鉴 定方 法 和基 于细菌 组 Ｄ Ａ 、Ｒ Ｎ ＮＡ 的分 子 生物学 技术及 基 因 水平 的快速 鉴 定方 法 。本 文着 重介 绍 几种 分 子 生 物学 技术在 乳酸 菌分 类 中的应用 。
Ｒｅ ｉｗ ｎ ｔ ｏ ｅ ｕｌ ｒＢｉ ｔ ｃ ｖ ｅ ｏ ｈｅＭ ｌｃ ａ ｏ ｅ ｈｎｏ ｏ ｙ ｆ ｒｔ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔｏ ｆＬａ ｔｃＡｃｄ ｌ ｇ ｏ ｈｅＩ ｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｃ ｉ ｉ ｉ
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摘 要： 介绍 了几种分子生物学技术在乳酸菌鉴定 中的应用， 并对这些方法的优缺点进行 了简单的阐述 ， 并对 该技 术今后 的发展 方 向做 了明确 的讨论 。 关键 词 ：分子 生物 学技术 ；乳 酸菌 ；分类 鉴定
中图分类号：Ｔ ９ ６ Ｑ ２ 文献标识码：Ａ 文章编ｇ：１７—１７ ０ １ ４０９— － ６ １ ８（ １） —１００ ５ ２ ０ ４
％）脉 冲场凝 胶 电泳 、 ＮＡ— ＮＡ 杂交 、 ＮＡ．ＮＡ 、 Ｄ Ｄ Ｄ Ｒ 杂 交 、各 种 Ｄ ＮＡ 分子 指纹 分析和 １ Ｓｒ ＮＡ基 因 ６ Ｒ 序 列 测 定 、 ｒ ＮＡ 转 录 间 隔 区 （ｎｅｇｎ ｎｃ Ｄ ｉｔ ｅ ｅ ｉ ｒ ｔ ｎｃｉ ｄ ｓａｅ，Ｉ Ｓ ｒ ｓｒ ｅ ｐ ｃｒ Ｔ ）序 列分 析测 定等Ｌ Ｊ ａ ｂ ２ 。它 曲 们 主要 是通 过 对乳 酸菌 染色 体 ＤＮ 进行 直接 的 Ａ
乳酸菌的分子鉴定及其发酵生产研究
乳酸菌的分子鉴定及其发酵生产研究乳酸菌是一类重要的微生物，它们可以对人体健康和食品质量有着积极的影响。
因此，乳酸菌的分子鉴定和发酵生产已成为当前生物技术领域的热点研究方向。
一、乳酸菌的分子鉴定1. 基于16S rRNA序列的分子鉴定16S rRNA序列是一种分子生物学技术，可用于确定细菌的分类位置。
通过对乳酸菌的16S rRNA序列进行分析，可以对其进行分子鉴定。
例如，可以通过利用PCR技术来扩增16S rRNA序列，并进行DNA测序，然后使用一些专门的软件来比对数据库中已有的乳酸菌序列，以此确定乳酸菌所属的种属和亚种属。
2. 基于质谱谱图的分子鉴定质谱谱图技术可以分析乳酸菌代谢产物的质谱图谱，并根据代谢物的组成、分子量和分子结构来鉴定乳酸菌的种属和亚种属。
例如，可以通过利用质谱仪来对乳酸菌发酵代谢产物的质谱谱图进行解析，然后将谱图与数据库进行比对，以此确定乳酸菌所属的种属和亚种属。
二、乳酸菌的发酵生产乳酸菌的发酵生产是一种很常见的生产方式。
下面我们将从乳酸菌的筛选及培养、选择发酵介质以及乳酸菌株种类等方面来阐述乳酸菌的发酵生产。
1. 乳酸菌的筛选及培养乳酸菌的筛选通常要经过多个步骤。
首先，需要从环境中分离出乳酸菌，然后进行预筛选，以去除不适宜生产的菌株。
接着，根据具体需求来确定乳酸菌的最终筛选条件，并进行强筛。
例如，可以通过对菌株进行分子鉴定，并对其菌株活力、乳酸生产能力以及耐受性等方面进行细致研究，以此筛选出适合生产的菌株。
2. 选择发酵介质乳酸菌的发酵过程需要选择适当的发酵介质。
通常使用的发酵介质包括糖类、蛋白质、乳类及酵母提取物等。
具体来说，糖类可以提供乳酸菌的生长和代谢所需的碳源，乳类则可以作为乳酸菌的营养来源。
对于蛋白质，可以促进乳酸菌生长并提高其产乳酸的能力。
3. 乳酸菌株种类乳酸菌株种类的选择对乳酸发酵生产有着至关重要的影响。
目前，市场上常见的乳酸菌株有Lactobacillus、Bifidobacterium和Streptococcus等。
分子生物学方法在食品微生物检测中的应用
一、概述食品安全一直是人们关注的重点问题，而微生物污染是导致食品安全问题的重要原因之一。
食品微生物检测技术的发展对于保障食品安全具有重要意义。
分子生物学方法由于其高度特异性和灵敏度，在食品微生物检测中得到了广泛的应用。
本文将就分子生物学方法在食品微生物检测中的应用进行探讨，旨在为食品安全领域的研究和实践提供参考。
二、分子生物学方法在食品微生物检测中的应用1. PCR技术2. 实时荧光PCR技术3. 微阵列芯片技术4. 基因测序技术5. 其他新兴分子生物学方法三、分子生物学方法在食品微生物检测中的优势与挑战1. 优势1.1 高度特异性1.2 高度灵敏度1.3 快速性1.4 可定量性2. 挑战2.1 样品前处理的标准化2.2 数据分析的标准化2.3 成本控制四、分子生物学方法在特定食品微生物检测中的应用案例1. 肉制品中致病菌的检测2. 奶制品中乳酸菌的检测3. 水产品中霉菌的检测4. 蔬果制品中寄生虫的检测5. 其他食品中常见微生物污染的检测五、分子生物学方法在食品微生物检测中的未来发展1. 新技术的不断涌现2. 多重技术的融合应用3. 检测标准的国际统一4. 自动化、智能化的检测设备的发展六、结论分子生物学方法在食品微生物检测中的应用已经取得了显著的成果，为食品安全领域的进步作出了重要贡献。
随着技术的不断进步和发展，相信分子生物学方法在食品微生物检测中将会发挥越来越重要的作用，为保障人们的饮食安全提供更为可靠的技术支持。
希望该领域的科研人员和实践者能够不断探索创新，共同致力于食品安全事业的发展。
七、分子生物学方法在食品微生物检测中的优势与挑战分子生物学方法在食品微生物检测中具有诸多优势，首先是高度的特异性。
传统的微生物检测方法可能对多种微生物都具有一定的反应，而分子生物学方法可以设计特异性的引物或探针，只对目标微生物进行检测，避免了其他微生物的干扰，提高了检测的准确性。
其次是高度的灵敏度，分子生物学方法可以检测到微生物的极低浓度，可以在微生物含量较低的食品样品中提高检测的准确性和可靠性。
PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用
PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用王庭柱，高学军，杨振宇东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030）E-mail：wangtingzhu1980@摘要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如RAPD、PCR-RFLP、T-RFLP、ARDRA、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGE、AFLP、REP-PCR、S-PCR、LCR、LH-PCR、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。
本文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。
关键词：乳酸菌，PCR，分类，鉴定，分子生物学1. 引言乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发酵。
LAB这个名称就细菌分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。
目前从自然界中已发现的这类细菌在分类学上至少可划分为23个属，涉及到的有关菌种则更多，其代表性的菌属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等[1,2]。
传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些LAB的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3]。
表型试验可能的固有问题是，不是每一给定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异性。
此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。
因此基于表型试验的常规技术并不能对菌株做出明确的鉴定[4]。
分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用
基 因 型鉴 定 法 以核 酸 为 检 测 对 象 ， 其 更 加 灵 敏 和 准 确 而 迅 速 而 准 确 的 在 亚 种 和 菌 株 水 平 上 对 乳 酸 菌 进 行 鉴 别 和 分 因 类 。这 种 根 据 菌 株 之 间 遗 传 距 离 而 导 致 的 Ｄ ＮＡ 指 纹 差 异 ； 被 国 内外 学 者 用 于 乳 酸 菌 的 鉴 定 。
征人群 、 秘人 群 的 胃肠 道有 明显 的改 善效 果 。 由于不 同 便
且 其 方法 自身检 测 的模 糊 性 ， 辨 率 不 高 ， 复 性 差 ， 结 果 受 分 重 且
基 菌 株 改 善 肠 道 的 机 制 不 同 ， 以 对 乳 酸 菌 在 菌 株 水 平 的 鉴 微 生 物生 长 条件 的影 响等 缺点 ， 于 表 型 特 征 的培 养 鉴 定 方 法 所
传 统 上 对 乳 酸 菌 属 的 鉴 定 主 要 根 据 菌 体 成 分 或 代 谢 产
多 的是 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 。益 生 菌 功 效 主 要 集 中在 维 持 和 物 在 同 种 属 间存 在 的 差 异 ， 过 测 定 这 些 成 分 的 含 量 进 行 通 调 节 机 体 的 正 常 肠 道 菌 群 上 并 由 此 产 生 一 系 列 的 益 生 作 菌 种 鉴 定 ， ： 酸 旋 光 性 的测 定 、 酸 菌 含 有 的 醌 分 析 、 如 乳 乳 细 用 ， 其 益 生 功 效 为 菌 株 依 赖 性 。 由 中 国 疾 控 中 心 营 养 与 但
随 着 人 们 生 活 品 质 的 提 高 ， 们 广 泛 关 注 益 生 菌 食 品 。 ２ 乳 酸 菌 的 鉴 定 方 法 人 益 生 菌 是 指 一 类 活 的 ， 入 足 够 量 就 可 以通 过 改 善 肠 道 微 ２ １ 表 型 鉴 定 法 摄 ．
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分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用近年来,乳酸菌的各种菌株用于多种食品和益生产品。
由于乳酸菌的益生功效为菌株依赖性,而单纯采用表型鉴定方法都无法准确鉴别到种属水平。
而基于DNA的基因型鉴定技术,因其检测的准确、稳定和灵敏可以实现乳酸菌种属甚至菌株水平的分类和鉴别。
本文对目前的主要分子技术在乳酸菌菌株分类和鉴定中的应用做一综述。
标签：乳酸菌;益生菌;鉴定;食品;分子技术随着人们生活品质的提高,人们广泛关注益生菌食品。
益生菌是指一类活的,摄入足够量就可以通过改善肠道微生态平衡而促进人体健康的微生物。
目前益生菌中应用较多的是乳杆菌和双歧杆菌。
益生菌功效主要集中在维持和调节机体的正常肠道菌群上并由此产生一系列的益生作用,但其益生功效为菌株依赖性。
由中国疾控中心营养与食品安全所牵头的研究结果证实,含有B益畅菌(即双歧杆菌DN173010)的酸奶能缩短肠道传输时间,对肠易激综合征人群、便秘人群的胃肠道有明显的改善效果。
由于不同菌株改善肠道的机制不同,所以对乳酸菌在菌株水平的鉴定就至关重要。
传统的表型法鉴定主要建立在形态学及生理生化特征基础上,但因其种间生化性状相似,单纯使用该法往往无法准确区分各个种。
随着分子标记技术的发展,基因型鉴定法以核酸为检测对象,因其更加灵敏和准确而被国内外学者用于乳酸菌的鉴定。
1 乳酸菌乳酸菌是存在于人体内的益身菌。
按照生化分类法,用于食品中乳酸菌分为5个属:乳秆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和汁球菌属,每个属包括多种菌种,某些菌种还包括数个亚种。
目前益生菌产品中应用较多的是乳杆菌属(Lactobacillaceae L)和双歧杆菌属(Bifidobacteria B)。
乳杆菌属中同型发酵乳秆菌包括:德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳秆菌(L.helveticus)、嗜酸乳秆菌(L.acidophilus)和干酪乳杆菌(L.casei);异型发酵乳杆菌包括:短乳秆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),主要用于发酵工业。
双歧杆菌属目前已知的双歧秆菌有24种,而应用于发酵乳制品生产的仅有5种包括:两歧双歧秆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧秆菌(B.breve)、婴儿双歧秆菌(B.infantis)和青春双歧杆菌(B.adolescentis),它们都存在于人的肠道内。
2001年我国卫生部公布的可用于保健食品的益生菌菌种包括:B.bifidum、B.infantis、B.longum、B.breve、B.adolescentis、L.bulgaricus、L.acidophilus、干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
而国外用于酸奶及微生物制剂的主要乳酸菌种包括:L.acidophilus、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、罗氏乳杆菌(L.rogosae)、植物乳杆菌(L.plantarum)、L.casei、詹氏乳杆菌(L.jensenii)、B.breve、B.longum、B.bifidum等。
2 乳酸菌的鉴定方法2.1 表型鉴定法传统上对乳酸菌属的鉴定主要根据菌体成分或代谢产物在同种属间存在的差异,通过测定这些成分的含量进行菌种鉴定,如:乳酸旋光性的测定、乳酸菌含有的醌分析、细胞壁肽聚糖组分和结构分析。
这种基于表面受体的特异性和生化特性的检测方法为表型特征鉴定法。
由于该方法无法显示菌体基因组信息,不能体现鉴别菌株间的亲缘关系,且其方法自身检测的模糊性,分辨率不高,重复性差,且结果受微生物生长条件的影响等缺点,基于表型特征的培养鉴定方法无法对乳酸菌进行准确的属或者种甚至菌株水平的鉴定。
2.2 基因型鉴定法近年来,学者们采用新的分子生物学和分子标记技术迅速而准确的在亚种和菌株水平上对乳酸菌进行鉴别和分类。
这种根据菌株之间遗传距离而导致的DNA指纹差异;从分子和基因水平研究和鉴定乳酸菌遗传结构、组成和分类的方法为基因特征鉴定法。
这种以DNA为基础的主要检测技术有:随机扩增多态性DNA (randomly amplified polymorphic DNARAPD)指纹图谱、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphismRFLP)、扩增片段长度多态性(Amplification fragment length polymorphismAFLP)、脉冲琼脂凝胶电泳(Pulse field gelelectrophoresisPFGE)、扩增性rDNA限制性酶切片段分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)。
2.2.1 16SrDNA/rRNA序列分析:从属到种的鉴定对生物大分子演变的研究是研究物种的近缘关系的很好工具。
16S rDNA或16S rRNA既具有保守性,又具有高变性,为细菌多态性研究最常用的靶基因。
Sul 等依据L.acidophilus、L.rhamnosus、B.longum、B.bifidum四种菌的16S rRNA、23S rRNA和16S-23S间区设计引物,快速准确的在属和种水平对四种乳酸菌进行鉴定。
2.2.2 脉冲琼脂凝胶电泳(PFGE)PFGE可用于乳酸菌的培养鉴定,乳酸菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavagerestric-tionendoucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。
该方法是在全基因组水平的分析,能对菌株的突变进行检测(DNA缺失,插入或重组),分辨率高。
已有多位学者利用该技术进行中水平的鉴别:B longum和B.animalis;L casei 和L.rhamnosus;Lacidophilus 和L.helveticus;Lb.johnsonii。
2.2.3 随机扩增多态性DNA指纹图谱(RAPD)RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA 多态性的方法。
利用随机引物(一般为8—10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。
扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。
RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测,也可用于构建基因组指纹图谱,具有种属甚至种间特异性。
与RFLP相比,RAPD技术简单,检测速度快;分析只需少量DNA样品且一套引物可用于不同生物基因组分析。
但是,由于该方法存在共迁移问题且该技术影响因素多,凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段,而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段,实验的稳定性和重复性差。
所以该技术通常与其他技术联用:Spano G等利用RAPD结合物种特异性PCR技术对红葡萄酒中L plantarum进行种水平的鉴定。
Schillinger U等采用L.casei 和L.acidophilus的种属特异性引物,结合RAPD-PCR分析,鉴别出益生菌酸奶中分离的20株乳酸菌,结果与标准菌株图谱对照,证明此法能实现乳酸菌的菌株水平的鉴别。
2.2.4 限制性片段长度多态性(RFLP)1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术,它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。
采用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。
通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。
它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。
该技术用于乳酸菌菌株种内水平鉴定的DNA指纹法。
Randazzo CL等结合PCR和RFLP技术从自然发酵的橄榄油中分离的35个同型发酵乳杆菌菌株中,分离出24个L casei,11 L plantarum.。
该方法具有RFLP标记位点数量不受限制的特点,但是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难;另外,该方法操作繁锁,且检测周期长检测成本高。
2.2.5 扩增片段长度多态性(AFLP)AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和V os发展起来的一种检测DN A多态性的新方法。
AFLP 是RFLP 与PCR相结合的产物,其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA 产生不同大小的DNA 片段,再使双链人工接头的酶切片段相边接,作为扩增反应的模板DNA,然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加1~3个选择性核苷酸作引物对模板DNA 基因再进行选择性扩增,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。
该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道DNA 信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。
为使酶切浓度大小分布均匀,一般采用两个限制性内切酶,一个酶为多切点,另一个酶切点数较少,因而AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。
AFLP 结合了RFLP 和RAPD两种技术的优点,具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。
Giorgio G等采用该技术对种族遗传学上关系密切的菌种进行物种水平的鉴定。
利用该技术遗传多样性的结果可以对种质进行聚类分析,Giorgio G等应用该法了解L pentosus,、L.plantarum和L.pseudoplantarum乳酸菌菌属的系统发育与亲缘关系。
但其技术费用昂贵,对DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。
尽管AFLP 技术诞生时间较短,但可称之为分子标记技术的又一次重大突破,被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。
3 结论酸菌的各种菌株已广泛应用于各种益生菌产品和食品中,表型生化鉴定法耗时耗力,且培养和生化鉴定结果易受到培养条件等诸多因素的影响,且主要缺点在于无法反应菌株的核酸信息。
基因型鉴定法准确、快速、灵敏,且分辨率高。
但是由于每种方法基于的原理不同和各种检测方法的优势不同,各种方法都一定的选择性和局限性。
目前,还没有一种方法能单独完成各种物种各种水平的检测。
所以,只有联合各种鉴别方法,充分利用各种方法的优势,且联合表型特征鉴定法和基因特征鉴定法,才能得到更为便捷、准确和灵敏的乳酸菌的分类和鉴别。