果聚糖果糖转移酶的研究进展_杭华

NO12 6841果聚糖果糖转移酶的研究进展杭华，郑翔宇，王路思，陈冬冬，鲍士宝*（安徽师范大学环境科学与工程学院，安徽 芜湖，241003）摘要：果聚糖果糖转移酶（levan fructotransferase ，即LFTase ）[EC 4.2.2.16]是将果聚糖（levan ）催化水解为双果糖酐IV （DFA IV ）的酶。

本文综述了果聚糖果糖转移酶的制备菌种、发酵工艺、分离纯化、酶学性质、酶解产物（DFA IV ）及其生理功能等。

关键词：果聚糖果糖转移酶，果聚糖，双果糖酐IV ，酶学性质，生理功能果聚糖果糖转移酶（levan fructotransferase ，即LFTase ）[EC 4.2.2.16]是指能够水解末端为蔗糖以β（2-6）糖苷键连接的果聚糖（levan ），它能从levan 为底物的非还原端切下2个果糖，通过分子间脱水，形成双果糖酐IV （Difructose anhydride IV ，即DFA IV ），见图1。

DFA IV 具有降血糖、促进矿物质元素的吸收、增进骨骼生长、改善便秘及抑制蛀牙等良好的生理功能；其能广泛地应用于食品与医药制剂的加工与生产。

Levan 主要来源于微生物产酶催化蔗糖聚合而成，为果糖基以β（2-6）糖苷键连接的多糖，为DFA IV 的制备提供原料。

然而，尚未见有关果聚糖果糖转移酶及其酶解产物-DFA IV 的中文综述文章。

本文对产酶微生物种类、酶学性质、表达酶学性质、酶解产物的制备及功能等方面进行综述，将为LFTase 与DFA IV 研究提供一定的参考价值。

图1果聚糖（左）与DFA IV 的化学结构Fig.1 Structures of levan (left) and difructose anhydrides IV1果聚糖果糖转移酶目前，双果糖酐IV 的生物转化方法主要包括微生物酶法、基因工程酶法、固定化酶水解法等。

随着微生物产果聚糖果糖转移酶（LFTase ）的研究越来越深入，大量有关产酶微生物分离与鉴定、发酵工艺、酶的分离纯化、分子改造及DFA IV 制备方法等方面的报道，这些工作为LFTase 的研究提供了更加广阔的空间。

1.1果聚糖（levan ）果聚糖（levan ）是果糖单元以β（2-6）糖苷键连接的多糖，末端含一个葡萄糖残基，作为双果糖酐IV 制备的原材料。

Levan 主要来源于微生物产酶催化蔗糖聚合而成，为果糖基以β（2-6）糖苷键连接的多糖。

Levan 存在于黑麦草与鸭茅等植物中，含量较少；它主要有化学法合成、微生物发酵液提取及微生物产果聚糖蔗糖酶（levansucrase ，EC 2.4.1.10）催化蔗糖聚合而成。

与植物果聚糖相比，微生物酶聚合果聚糖有较多的分支点和较高的聚合度。

植物来源的果聚糖分子量范围为2-34ku ，微生物来与的果聚糖分子量范围为2-100×103ku 。

果聚糖的聚合度一般含有7-35个果糖单元，少数为90-260个果糖单元[1]。

Levan 是较好的功能性食品原料，具有抗病毒与肿瘤、降低血糖和血脂等生物活性。

然而，levan 不易被人体吸收，限制其进一步的应用。

因此，DFA IV 适合于作为levan 进一步的研发产品。

1.2果聚糖果糖转移酶的来源早在1981年，Tanaka 等[2]首次报道应用Arthrobacter ureafaciens 培养产一种新酶-果聚糖果糖转移酶（LFTase ），该酶能催化水解Bacillus mesentericus 产levan 来制取DFA IV ，确定微生物的培养条件及酶活测定方法；在相似的实验条件下，该酶不能催化转化菊糖、蔗糖等生成DFA IV 。

经大量研究发现，LFTase 为胞外酶，可应用levan 果聚糖诱导发酵制取该酶的微生物，大部分属于节杆菌属，主要菌株：Arthrobacter ureafaciens ，Arthrobacter nicotinovarorans GS-9，Arthrobacter nicotinovarorans K2032，Arthrobacter oxydans J17-21，Microbacterium sp. AL-210，Baciilus sp. 3B6等[2-8]。

以上微生物大多为野生型菌株，均能分泌LFTase ，由于上述菌株培养的地方与方法的差异，获得酶的活性也不相同。

目前，国内尚未见该酶的相关研究。

国外对该酶的研究较多，Tanaka 等[2]采用Bacillus mesentericus产levan 为诱导物，筛选出产LFTase 的Arthrobacter ureafaciens ，该菌经发酵离心除去菌体得上清液（粗第一作者：杭华（1977年-），男，博士，讲师，研究方向：食品生物新技术 邮箱：2006hanghua@ 。

通讯作者：鲍士宝，博士，邮箱：shibaobao1980@基金项目：安徽师范大学12博士科研启动项目（161-070110），13年校项目培育基金项目（160-71361）。

酶液），经浓缩与硫酸铵沉淀后，测定比酶活力为5U/mg ，且该菌株具有稳定的遗传特性。

Saito [4]报道了网络出版时间：2014-10-17 14:04网络出版地址：/kcms/detail/11.1802.TS.20141017.1404.008.htmllevan为唯一碳源也能诱导Arthrobacter nicotinovorans GS-9产LFTase；经过培养条件优化后，上清液中酶活为3.3 U/mL；该酶也能高效地催化levan生成DFA IV及少量的副产品（果糖）。

Soog等[5]报道了从含糖土壤中分离获得Arthrobacter nicotinovarorans K2032产LFTase的酶学特性，获得比酶活力为45.9 U/mg。

Jang等[6]研究了来源于Arthrobacter oxydans J17-21产LFTase催化水解levan生成DFA IV，酶比活力为15 U/mg。

1.3 酶的发酵与分离纯化1.3.1酶的发酵目前，传统的微生物发酵工艺为制备LFTase的主要方法。

该酶为胞外酶，酶蛋白主要存在于发酵液，经低温离心后，除去菌体获得上清液（粗酶液），发酵条件易控制，能应用于大规模工业化生产。

Soog等[5]对产LFTase的Arthrobacter nicotinovarorans K2032采用的培养基（g/L）包括20 levan，3酵母膏，3 NaNO3，0.5 MgSO4，0.2 MnCl2，1 K2HPO4；30℃，培养48h；经离心（6000rpm，10min）后，除去菌体获得粗酶液。

Jang等[6]对产LFTase的Arthrobacter oxydans J17-21的发酵培养基（g/L）为10 levan，3酵母膏，3 NaCO3，0.5 MgSO4，0.2 MnCl2，1 K2HPO4；30℃，培养40h；经离心（4000rpm，30min）后，除去菌体获得粗酶液。

1.3.2 分离纯化酶分离纯化的方法主要包括离心、浓缩、盐析、凝胶过滤、层析分离等。

酶纯化时，需考虑不同因素对酶活力的影响，尽量减少酶活损失，提高酶的纯度及回收率等。

由于酶蛋白受温度影响较大，常在较低温度下综合考虑上述方法进行分离纯化。

目前，LFTase的分离纯化研究主要应用硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、凝胶层析与离子交换层析等方法。

1983年，Tanaka等[3]首次对该酶进行分离纯化研究，酶经硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析及Sephadex G-200凝胶层析等方法，将Arthrobacter ureafaciens产LFTase的比活力由5.0U/mg增加至29.4U/mg，纯化倍率为5.88。

2000年，Soog等[5]采用丙酮沉淀、DEAE-离子交换层析、Mono Q离子交换层析、Superose 12凝胶层析等方法，将Arthrobacter nicotinovarorans K2032产LFTase 的比酶活力由45.9U/mg提高至2269.0U/mg，纯化倍率达到49.4。

2003年，Jang等[6]利用硫酸铵沉淀、Sepharose-Q离子交换层析、Mono Q离子交换层析、凝胶层析等方法，将Arthrobacter oxydans J17-21产LFTase的比酶活力由15U/mg提高至1432U/mg，纯化倍率达到95.5。

综上所述，沉淀法、离子交换层析法及凝胶层析法等相互结合的方法是有利于LFTase的分离纯化。

2 果聚糖果糖转移酶的性质2.1 酶蛋白的相对分子质量及N端氨基酸序列不同来源的LFTase相对分子质量差异较大。

Tanaka等[3]报道Arthrobacter ureafaciens经培养分泌LFTase，其相对分子量经Sephadex G-200凝胶电泳检测为12.8ku，十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶（SDS-PAGE）圆盘电泳检测分子量为6ku，表明该酶由两个等同的亚基组成，说明该酶为二聚体。

Saito[4]报道从Arthrobacter nicotinovarorans GS-9分离鉴定出LFTase，经凝胶电泳与SDS-PAGE检测均为51ku，说明该酶为单聚体；N端氨基酸序列为HAQASLRAIYHMTPPSGWLC。

Soog等[5]研究了来源于Arthrobacter nicotinovarorans K2032产LFTase，经凝胶电泳检测为96ku，SDS-PAGE测定为51ku，表明该酶由两个相似的亚基组成，说明该酶为二聚体；N端氨基酸序列为SAPGSLRAVYHMTPPSGXLXDPQ。

Jang等[6]研究来源于Arthrobacter oxydans J17-21产LFTase，纯化后SDS-PAGE检测为5.4ku；N端氨基酸序列为AQGSQXAVYXMTPPSGWLXD。

Cha等[7]报道Microbacterium sp. AL-210产LFTase，经凝胶电泳检测为46ku，SDS-PAGE 测定为46ku，说明该酶为单聚体；N端氨基酸序列为AASGSLRAVYHMT。

由此可见，不同来源的LFTase相对分子质量差异较大，即使是同一菌属的不同菌株产果LFTase相对分子质量也存在差异；LFTase酶蛋白的氨基2.2 酶学性质目前已研究微生物产LFTase的最适pH为5.8-7.0，最适温度为20-45℃，pH稳定性范围为4.0-11.0，激活剂为钙盐、钠盐等，抑制剂主要有亚铁盐、汞盐、锌盐、锰盐、银盐等。

该酶具有良好的pH稳定性、较为适合的温度范围以及较为常见的激活剂，这有利于其大规模的工业化应用（见表1）。