shiyan26植物体内多酚氧化酶活性的测定
生化实验报告
生化实验报告单位：学号：姓名：实验1.多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、实验原理与目的氧化形成为醌，使组织形植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。
多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、实验材料与试剂1.材料：马铃薯（大约每小组100-200g）2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml； NaCl；聚乙二醇： DEAE－纤维素 DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200:三、实验步骤（1）粗酶提取：马铃薯丁按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
（2）盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M 巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质
实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。
2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。
二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。
酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。
其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。
多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。
多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。
因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。
多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O2——————→邻醌＋H2O三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。
2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。
多酚氧化酶
简介
多酚氧化酶(polyphenol oxidase， 简称PPO）是一类广泛存在于植 物体内的含铜金属酶类.由于其与 果蔬加工、品质等密切相关,人们 很早就开始对它进行深入细致的 研究.
• 铜是酶的活性中心，从蛋白质中除 去一部分或全部铜，将引起酶活性 下降或完全失活，若添加铜的话， 酶活又能恢复。不同果蔬中的PPO铜 辅基的数量会有所不同，如蘑菇中 PPO含4个铜原子，而扁豆的PPO含1 个铜原子。
琼酯糖凝胶
已装柱好的苯基琼脂糖 PenlysepharoseCL4B柱,用高盐缓冲 液A预平衡, 酶液借助梯级蠕动泵加 在柱上,洗脱液以一定流速,从高盐缓 冲液A减弱至低盐缓冲液B,最后以 50%的乙二醇进行洗脱 。由紫外监 控器(280nm)监控，调节分级收集器 流速收集。
酶活性测定 测定波长视底物而定,测定 温度为25℃,反应液由pH4的柠檬 磷酸缓冲液、测定底物和酶液组 成,一个酶活力单位为测定条件下, 每分钟引起光密度改变0.001所需 的酶量。
葡聚糖凝胶
文献报道植物组织中PPO分子量一般 介于40-70K之间，根据葡聚糖凝胶分离大 分子的原理，葡聚糖凝胶分离PPO与杂蛋白。 不同型号凝胶的分离范围是根据球形蛋白 理论模型确定的，而实际分离蛋白的结构 与理论模型常有较大差异，因此在纯化PPO 时，采用不同型号的葡聚糖凝胶进 行分离效果的比较。
包括Sepharose和Bio-gel A等。 Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形Sepharose CL型凝胶（CL-2B ~4B），分离特性基本没变，
琼脂糖是从琼提高，可以在更
广泛的pH范围内应用。
琼脂糖凝胶稳定性要超过一般的葡聚糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样 品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶的机械强 度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两 种凝胶，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以 比较快。 琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范 围很广，适合于分离大分子物质，但分辨 率较低。琼脂糖凝胶不耐高温。
植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
实验七植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
一、实验目的
掌握植物组织内过氧化物酶活性测定的原理和方法。
二、实验原理
过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。
三、实验材料与设备
1．实验设备与仪器
电子天平、冰冻高速离心机、可见光分光光度计、电动玻璃匀浆剂等。
2．实验材料与试剂
20mM KH2PO4，
100mM PBS：取0.2M Na2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。
反应液：取100mM PBS 50ml，加入愈创木酚28μl，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H2O219μl，混合均匀保存于冰箱中备用。
四、实验步骤
1．酶液制备
取1.0g植物叶片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的20mM KH2PO45ml进行冰浴研磨提取。
匀浆液低温离心8500rpm 15min，上清液为酶粗提液，定容到50ml供测定。
2．酶活性测定
取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mMKH2PO41ml作为调零管。
另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。
3．计算
以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g鲜重）。
国标测土壤多酚氧化酶分光光度法
国标测土壤多酚氧化酶分光光度法简介：多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，简称PPO）是一种存在于植物和动物组织中的酶类，广泛参与了许多生物体的物质代谢过程。
土壤中的多酚氧化酶在有机物的降解和土壤养分循环中发挥着重要的作用。
国家标准（GB21605-2008）中规定了利用分光光度法测定土壤多酚氧化酶活性的方法。
原理：该方法主要基于土壤中多酚氧化酶的活性，对酚类底物在多酚氧化酶作用下进行催化氧化反应，生成酚醌类产物。
通过测定产物在特定波长下的吸光度变化，进而确定多酚氧化酶的活性。
实验步骤：1.准备土壤样品：收集需要研究的土壤样品，并根据实验要求进行处理和干燥；2.制备土壤提取液：将土壤样品加入磷酸盐缓冲液中，并通过振荡或超声等方法进行充分混合；3.离心提取液：待提取液沉淀后，取上清液并将其离心；4.提取液的酚类物含量测定：将提取液加入含有酚醌类底物的溶液中，并在特定温度下进行反应；5.测定吸光度：根据特定波长下产生的酚醌类产物吸光度变化进行测定；6.计算多酚氧化酶活性：通过计算吸光度变化量，结合实验条件和标准曲线等数据，计算得到多酚氧化酶活性。
注意事项：1.样品的处理和提取过程应严格控制，避免对多酚氧化酶活性的影响；2.实验操作需要在一定温度下进行，以保证反应的准确性和可重复性；3.实验过程中需要使用吸光度计等仪器设备进行测量，确保所得结果的准确性。
优缺点：这种多酚氧化酶分光光度法在土壤中多酚氧化酶活性的测定中具有许多优点。
首先，操作简便，不需要复杂的设备和条件，适用于中小型实验室。
其次，该方法具有较高的灵敏度和特异性，能够准确地测定土壤中多酚氧化酶的活性。
此外，该方法还具有较好的重复性和可靠性，能够满足土壤生态学和环境科学中对多酚氧化酶活性的测定需求。
然而，该方法也存在一些不足之处。
首先，该方法对土壤样品的处理和提取过程较为敏感，需要仔细控制操作条件，以避免对多酚氧化酶活性的影响。
其次，由于该方法只能测定土壤样品中多酚氧化酶的总活性，对于活性的来源和特定酶类的测定有一定限制。
植物酶活指标
植物酶活指标植物酶活性指的是植物体内酶的催化活性程度，也称为酶活力。
植物体内酶活性与植物生长发育、代谢、环境适应能力等密切相关。
因此，研究植物酶活性指标具有重要的科学意义和应用价值。
一、植物酶活指标的类型1、氧化还原酶：包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等。
2、酯酶：包括脂肪酶（LIP）和酯酶（EST）等。
3、氨基酸、蛋白质和多糖酶：包括谷氨酸脱氢酶（GDH）、丝氨酸脱酸酶（SDH）、多酚氧化酶（PPO）、多酚酶（POD）、木质素过氧化物酶（LPO）和纤维素酶等。
二、植物酶活指标的意义1、判断环境胁迫：有研究表明，氧气自由基及其产生的活性氧分子是植物生长发育、代谢过程中的一个重要因素。
而氧化还原酶在植物体内具有极高的活性，能够迅速清除氧气自由基及其产生的活性氧分子。
因此，通过测定植物体内氧化还原酶活性，可以判断环境胁迫程度及其对植物的影响。
2、评估生长发育状态：氨基酸、蛋白质和多糖酶等酶在植物体内能够催化孢子、芽、花、果实等生长发育过程中的代谢反应。
因此，可以通过测定这些酶活性的变化，来评估植物的生长发育状态。
3、诊断植物病害：植物病害的发生与否及其严重程度，常常会影响植物体内某些酶的活性，如过氧化物酶和谷氨酸脱氢酶等。
因此，通过测定植物体内的酶活性，可以较为准确地诊断植物病害。
三、植物酶活指标的测定方法1、样品的预处理：将植物材料（如叶片、根、果实等）取出后，立即将其冷冻或干燥，以避免其酶活性受到破坏。
2、酶活测定方法：根据不同酶的特点和催化反应特性，选择相应的酶活测定方法。
如氧化还原酶可以采用光谱方法或电化学法进行测定，酯酶可以采用碳酸酯法、碱式溶液法或带有色团的底物法进行测定，而氨基酸、蛋白质和多糖酶可以采用比色法、光度法或重量法进行测定。
四、植物酶活指标的应用1、农业生产领域：在农业生产中，常常需要对作物的生长发育状态和抗逆能力进行评估，而植物酶活指标的变化能够反映出相应的信息，因此可以用于指导作物的种植和环境调控。
（精选）保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（pod）活性测定1、酶液的制备...
保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。
2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05 mol/L 愈创木酚溶液（2-甲基酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、过氧化物酶活性测定：（1）加入反应混合液2.9 ml磷酸缓冲液1 ml愈创木酚溶液（2-甲基酚）1 ml H2O20.1ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并加入2ml三氯乙酸溶液终止反应（3）过滤，适当稀释。
在470nm处测OD470。
5、结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。
即酶活力=OD×D / 0.01t酶的比活力= OD×D /（0.01tw）其中：OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t为反应时间D为稀释倍数。
即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数二、多酚氧化酶（PPO）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。
2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05mol/L儿茶酚溶液（邻苯二酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、多酚氧化酶活性测定：（1）加入反应混合液3.9 ml磷酸缓冲液1 ml 儿茶酚溶液0.1 ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并立即加入2ml三氯乙酸溶液终止反应。
（3）过滤，适当稀释。
植物体内过氧化物酶活性的测定
以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为1个过氧化 物酶活力单位，即：
w:大麦苗鲜重 t：反应时间 D：稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数
附注������ 酶的提取纯化需在低温下进行。 思考题 测定酶的活力要注意控制哪些条件？
（1）保持待测材料的酶活； （2）测定时注意控制反应时间；
操作步骤
1．酶液提取：称取0.5g白菜叶片于研钵中 →加入2ml磷酸缓冲溶液→研成匀浆→转入 10ml刻度试管中→再加3ml磷酸缓冲溶液冲 洗研钵→转入10ml刻度试管中→以KH2PO4 溶液定容 →再转入离心管中→4000r/min 4℃下离心15min →倾出上清液至刻度试管 中→4℃下保存。
实验二
植物体内过氧化物酶活性的测定
实验目的
学习和掌握过氧化物酶(POD)活性测定 的原理及方法。
背景知识
线粒体通过呼吸作用，一方面为细胞各项活动提 供能量，另一方面也可通过呼吸链电子传递途径 产生超氧阴离子，并通过链式反应形成对机体有 损伤作用的活性氧。 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是超氧阴 –）、过氧化氢（H O ）、羟自由基 离子（O2· 2 2 （· OH）和单线态氧（1O2）等几种分子的总称， –和H O 是所有活性氧的源头。 其中O2· 2 2 生物体内产生的活性氧若得不到及时清除，就会 在细胞中积累，引起细胞凋亡。
操作步骤
2. 取试管2只、1只加入3ml反应混合液， 1m120mmol/lKH2PO4液作为对照；另1中加入3ml 反应混合液，1ml酶液(若活性高则稀释之)，混匀 后倒入比色皿中，于分光光度计上测定吸光度值， 每隔30s读数一次，波长为470nm，至吸光值变化 极微小后停止。
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实验二十六 植物体内多酚氧化酶活性的测定
一、目的
通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用
分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如
下：
多酚氧化酶
邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌 ＋ H2O
三、材料、仪器及试剂
1. 材料：
马铃薯块茎等
2. 仪器：
UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；
移液管；纱布袋等。
3. 试剂：
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5
磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；
20％三氯乙酸。
四、实验步骤
1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，
然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，
滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉
淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃
恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色
杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算
以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
A 酶提取液总量（ml）
酶活力（0.01A·min－1）＝———————×———————————
0.01×反应时间 测定时酶液用量（ml）
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A 酶提取液总量（ml）
酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×——————————
0.01×W×反应时间 测定时酶液用量（ml）
公式中：A — 为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。