原花青素值的测定
四种原花青素含量测定方法比较
四种原花青素含量测定方法比较一、本文概述原花青素（Procyanidins）是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物，因其强大的抗氧化和生物活性，近年来在营养学、食品科学、医药学等领域受到了广泛关注。
其中，四种主要的原花青素——儿茶素（Catechin）、表儿茶素（Epicatechin）、没食子儿茶素（Gallocatechin）和表没食子儿茶素（Epigallocatechin）的含量测定对于评估食品营养价值、研究药物作用机制以及监控产品质量具有重要意义。
本文旨在比较和分析目前常用的四种原花青素含量测定方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、紫外可见分光光度法（UV-Vis）、荧光光谱法（Fluorometry）和质谱法（MS），以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考。
通过比较这些方法的准确性、灵敏度、操作简便性以及成本效益等方面的优劣，我们期望能为科研人员和企业选择最适合的原花青素含量测定方法提供指导。
二、方法概述原花青素（Procyanidins）是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物，具有强效的抗氧化性能，对多种疾病具有预防和治疗作用。
由于其生物活性的重要性，对原花青素含量的准确测定显得尤为重要。
目前，常用的原花青素含量测定方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、紫外可见分光光度法、薄层色谱法（TLC）和毛细管电泳法（CE）。
这些方法各有优缺点，适用于不同的样品类型和实验条件。
高效液相色谱法（HPLC）具有高分辨率、高灵敏度、高重现性等优点，可以同时分离和测定多种原花青素。
但是，该方法需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，且样品处理过程繁琐，分析时间较长。
紫外可见分光光度法是一种简便、快速的测定方法，适用于大量样品的初步筛选。
然而，该方法只能测定总原花青素的含量，无法区分不同种类的原花青素，且易受样品中其他色素的干扰。
薄层色谱法（TLC）是一种基于原花青素在薄层板上的分离和显色进行测定的方法。
原花色素的提取及测定
原花色素的提取及测定一、实验原理原花色素，也称原花青素，是一类从植物中分离得到的在热酸条件下能产生花色素的多酚化合物，它既存在于多种水果的皮，核和果肉中，如葡萄，苹果，山楂等。
也存在于如黒荆树，马尾松，思茅松，落叶松等的皮和叶中。
原花色素属于生物类黄酮,它们是由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成，最简单的原花色素是儿茶素的二聚体，此外还有三聚体，四聚体等。
依据聚合度的大小，通常将二至四聚体称为低聚体，而五聚体以上的称为高聚体。
从植物中提取原花色素的方法一般有两种，分别是用水抽提或用乙醇抽提。
其抽提物为低聚物，称之为低聚原花色素（OPC）。
原花色素具有很强的抗氧化作用，能清除人体内过剩的自由基，提高人体的免疫力，可作为新型的抗氧化剂用于医药、保健、食品等领域。
利用低聚原花色素溶于水的特点，用热水煮沸抽提原花色素，再用大孔吸附树脂吸附、洗脱得到原花色素。
D101树脂是一种球状、非极性交联聚合物吸附剂，具有相当大的比表面和适当的孔径，对皂甙类、黄酮类、生物碱等物质有特殊的选择性，适用于从水溶液中提取类似性质的有机物质。
原花色素（I）的4~8连接键很不稳定，易在酸作用下打开。
反应过程（以二聚原花色素为例）是：在质子进攻下单元C8（D）生成碳正离子（II），4~8键裂开，下部单元形成（-）-表儿茶素（III），上部单元成为碳正离子（IV），失去一个质子成为黄-3-烯-醇（V），在有氧条件下失去C2上的氢，被氧化成花色素（VI），反应还生成相应的醚（VII）。
若采用正丁醇溶剂可防止醚的形成。
（如下图所示）在一定浓度范围内，原花色素的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的原花色素含量。
但盐酸-正丁醇法受原花色素的结构影响较大，对于低聚度原花色素及儿茶素等单体反应不灵敏。
二、实验器材新鲜山楂，烧杯，玻璃层析柱，大孔吸附树脂D-101，具塞试管*9，移液枪，紫外分光光度计，水浴锅；三、实验试剂60%乙醇，95%乙醇，原花色素标准品(1.0mg/mL)，HCl-正丁醇，2%硫酸铁铵，2.0mol/L HCl；四、实验步骤Ⅰ原花色素的制备1、称取新鲜山楂10.0g，剪成块状，置入锥形瓶中，加入40.0mL蒸馏水，沸水浴30min，间期混匀。
花青素检测内容和方法
花青素检测内容和方法花青素检测是一项重要的化学分析技术，用于测定植物和食品中的花青素含量。
花青素是一类常见的天然色素，具有抗氧化和抗炎作用，因此对其含量进行快速和准确的测定具有重要的科学和应用意义。
以下为50条关于花青素检测内容和方法的详细描述：1. 花青素是一类具有紫、蓝、红等颜色的天然色素，主要存在于植物的花朵、果实和叶子中。
2. 花青素的主要类型包括花色素苷、原花青素和异花青素等，它们在植物中起着色素和抗氧化作用。
3. 花青素检测的方法包括分光光度法、高效液相色谱法、质谱法等，常用的是分光光度法和高效液相色谱法。
4. 分光光度法是利用物质吸收特定波长的光线进行测定，通过比色法或比浊法来测定花青素的含量。
5. 高效液相色谱法是利用高效液相色谱仪进行测定，通过分离和检测样品中的花青素成分来计算含量。
6. 质谱法是利用质谱仪进行测定，通过记录花青素分子的质荷比来确定其含量。
7. 花青素检测常用的标准曲线方法是通过不同浓度的标准品制备标准曲线，再根据待测样品吸光度的测定值来计算含量。
8. 花青素的提取方法包括有机溶剂提取、酸碱水提取、超声波提取等，不同样品可选择合适的提取方法。
9. 有机溶剂提取是利用乙醇、丙酮等有机溶剂将花青素从植物组织中提取出来，然后通过浓缩和干燥得到提取物。
10. 酸碱水提取是利用酸性或碱性水溶液将花青素从植物组织中提取出来，可以有效保留花青素的天然结构。
11. 超声波提取是利用超声波功率促使样品中的花青素溶解在有机溶剂或水中，提高了提取效率。
12. 花青素的测定结果可根据测定方法的不同而有所差异，因此需要在同一实验条件下进行多次重复测定来确保结果的准确性。
13. 在花青素检测过程中，可能会受到样品中其他化合物的干扰，因此需要进行干扰检查和修正。
14. 花青素检测结果可以用于评价植物的品质、食品的营养价值和天然色素的应用价值。
15. 花青素检测在食品工业中具有重要的应用，如在果汁、酒类、饮料等产品中进行质量控制。
红米原花青素的测定方法
红米原花青素的测定方法红米原花青素的提取及测定方法1、标准曲线的配置标准溶液的配制，用甲醇配制原花青素母液2mg/mL标准液配制：母液：2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 7ml 8ml甲醇：8ml 7ml 6ml 5ml 4ml 3ml 2ml2、试剂试剂a：10g/L香草醛甲醇溶液，10g香草醛溶于1L甲醇溶液试剂b：245ml浓硫酸（18.4mol/L）溶于500ml甲醇溶液，并用甲醇定容直1L。
3、提取方法将红米磨粉后称0.5g，放入15ml试管中，加入8ml的80%甲醇溶液，至于黑暗的地方，每隔2h左右振荡一次，一直浸泡提取8小时。
4、测定方法吸取1ml提取液或标准液，加入10ml离心管中，然后依次加入2.5ml试剂a和2.5ml试剂b，混匀后35℃下水浴20min，水浴结束后8000rm离心10min，用移液器取上清液测定其在500nm下的吸光值。
5、参考文献：1、Sun B, Ricardo-da-Silva JM, Spranger I Critical Factors of Vanillin Assay for Catechins and Proanthocyanidins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46: 4267-42742、Gunaratne A, Wu K, Li D, et al. Antioxidant activity and nutritional quality of traditional red-grained rice varieties containing proanthocyanidins. Food Chemistry, 2013, 138: 1153-1161。
原花青素的鉴定
采用盐酸-香草醛法，以儿茶素为标准物。
HPLC-MS色谱及质谱条件
1.2.6.1色谱条件
色谱柱:Pinnade ⅡC18分析柱,Agilent公司,5μm , 4.6 ×250 mm。流动相:A:水-体积分数为2 %甲酸;B:甲醇。梯度洗脱:0～5 min , 95 %A+5 %B ;5～25 min , 95 %A +5 %B ※100 %B ;25～30 min ,100 % B。流速1mL/min,进样量20 μL,柱温:30 ℃,检测波长280 nm。
DMACA（P-DimethylaminocinnamalCA盐酸-甲醇溶液
DMACA盐酸-乙醇溶液中，DMACA的浓度为0.5-2%，盐酸浓度为10-15%，乙醇浓度为45-55%
DMACA盐酸-甲醇溶液中，DMACA的浓度为0.5-2%，盐酸浓度为8-14%，甲醇浓度为50-55%
1.2.6.2质谱条件
ESI离子源，一级质谱；扫描方式：负离子扫描；扫描范围：m/z为100～1500范围内扫描。毛细管电压4.2kV，锥孔电压50V，毛细管温度350 ℃。
UV检测(ultraviolet detection)
在用HPLC分析鉴定原花青素用时，UV检测器是最常用的。但是由于许多酚类化合物在UV区都有吸收,因此用UV检测器从酚类化合物中专一检测原花青素很困难,为了克服这一问题,Lazarus等报道有学者提出一种通过原花青素与DMACA柱后进行反应,其生成的产物在640 nm处有特征吸收的方法鉴定原花青素
原花青素的含量测定方法
花青素含量。通过在特定的波长或某一范围的波长下，
测定待测物品的吸光度，近而对原花青素进行定量分
析。
原花青素(procyanidins，简称 PC)是植物中广泛存在的一类属于双黄 酮衍生物的天然多化合物，原花青素具有极强的抗氧化特性，一般存在 于植物的果实、种子、花和皮中，在葡萄、山楂、花生、银杏、白桦树、 松树等植物中的含量都很丰富。在原花青素各种不同聚合体中以二聚体 的抗氧化能力最强．原花青素具有多种生物活性，能防治多种疾病，具 有高效、低毒、高生物利用率等特点，在植物中的主要作用是保护植物
NH4Fe(SO4)2 溶液和6mL盐酸正丁醇溶液，盖塞，摇匀，于95℃的水
浴中加热反应40min 取出，于冷水中迅速冷却，溶液显红色，以0mL
溶液作为空白对照，于546nm 处测定其吸光度。采用最小二乘法作
原花青素浓度(C)与吸光度( A ) 线性回归方程。
结果见表
取得标样体 积（/ml）
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
对应标样浓
度（mg/ml)
测的吸光度
值A
b. 样品测定 分别精确吸取10mL 样品，用95%乙醇定容于50mL 容量瓶。吸取上述样 品待测液3mL 于25mL 具塞试管中，按标准曲线制作项下的操作步骤， 依次分别加入0.2mL 2％NH4Fe(SO4)2 溶液、6mL 盐酸正丁醇溶液（注 释：NH4Fe(SO4)2 溶液， 盐酸正丁醇溶液在这里都是分析纯。是大孔 树脂对原花青素的纯化食盐中的分析纯部分）加热，测其吸光度。根据 标准曲线计算出结果，按其稀释倍数求得各样品中原花青素含量。 4. 结果与分析
中易被氧化的成分，在人体内的抗氧化和清除自由基的能力是 V-E50 倍，并且还具有保护心血管、预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗突变及 美容等作用． 1. 实验原理 朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律， 是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸 光度 A 是吸光物质的浓度 C 及吸收介质厚度 l(吸收光程)的函数。 比耳的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定液层厚度的均匀溶液 时，A 与 C 成正比，其数学表达式为:
原花青素含量检测的概述
原花青素含量检测的概述原花青素含量检测的概述【摘要】对目前原花青素常用的检测方法进行了对比并阐述了各种方法的优缺点，为探索更好的原花青素的测定方法奠定基础。
【关键词】原花青素；检测；含量原花青素是一类广泛存在于植物中的黄烷醇单体及其聚合体的多酚类混合物，具有抗氧化和自由基清除能力等生物活性。
自20世纪60年代以来，在保健品、医药和化妆品领域获得了广泛应用。
研究表明[1]，儿茶素和表儿茶素是构成原花青素的结构基础，继而形成缩合成二聚体、三聚体至高聚体。
且单体具有旋光性，因此要想测定每一种成分的含量非常困难。
目前国内外对原花青素含量的测定方法尚未统一，现介绍几种常用的方法。
1.可见分光光度法[2]原花青素最常用的测定方法是可见分光光度法，它分为KMnO4法[3]、正丁醇-盐酸法、香草醛-强酸法、铁盐催化比色法、和pH示差法等。
正丁醇-盐酸法、香草醛-强酸法两种方法是目前普遍采用的相对专一、灵敏的、简单迅速测定原花青素的方法。
1.1 Porter法（Bate-smith法）又叫盐酸-正丁醇法，是依据原花青素在无机酸和加热的条件下被降解，产生红色花青素，在546nm处有最大吸收，原花青素的含量与吸光度值符合朗伯-比尔定律[4]。
在强酸作用下，聚合原花青素单元间的连接键易被打开，上部单元生成黄烷-3-醇，下部单元生成花色素。
而对于黄烷3，4-二醇单体原花青素来说，C-4位有极强的亲电性，其醇羟基与C-5，C-7上的酚羟基形成了一个苄醇系统，使得4位碳易于生成正离子。
在强酸作用下，正碳离子失去质子，生成花色素[5]。
对于黄烷-3-醇单体，不会有正离子形成，因此与儿茶素和表儿茶素的单体不发生显色反应。
此法对原花青素具有专一选择性，儿茶素、黄酮类、棓酸类及水解单宁类化合物皆不具备此反应，不适宜于低聚原花青素的测定，它与原花青素的高聚体反应也不完全。
随后，Porter等对该法的反应条件进行了探索，并认为Fe3+、Co2+、Cu2+等金属离子可催化加速自氧化过程，提高转化率，其中以Fe3+的催化效果最好。
沙棘及其提取物中原花青素含量的分析测定
沙棘及其提取物中原花青素含量的分析测定沙棘（HippophaerhamnoidesL.）是一种难得的野生果实，其可食的果实具有极强的营养价值，从根、叶和果实中提取的植物提取物中蕴含着大量药用和营养成分，其中原花青素也是其中重要的成分之一。
近年来，原花青素对抗自由基、抗衰老、抗癌、促进肠道菌群平衡等作用引起了科学研究者的重视，因此，正确测定沙棘及其提取物中原花青素的含量具有重要的意义。
一、原花青素的特点原花青素（Proanthocyanidins）是一种葡萄糖丝氨酸糖基化产物，它由维生素C和黄酮类物质组成。
由于原花青素具有抗氧化、抗自由基、抗衰老、促进肠道健康、抗癌等作用，野生沙棘中其含量较高，因此受到学者们的广泛关注。
二、沙棘中原花青素的测定沙棘中原花青素的测试主要分为两种，即HPLC和核磁共振氢谱法。
最常用的测定方法为HPLC法。
该方法可以对原花青素的含量进行精确测定，从而获得准确的数据。
此外，核磁共振氢谱法也常用于测定沙棘中原花青素的含量。
值得注意的是，由于原花青素的性质和结构特征十分复杂，在测定过程中必须采用一定的标准和质量保证措施，以确保测定结果的准确性。
三、沙棘及其提取物中原花青素测定方法的优点1、有效率高：HPLC测定方法有效率高，可以很快的获得沙棘及其提取物中原花青素的测定结果，为下一步应用提供了有效的帮助。
2、精度高：核磁共振氢谱法测定准确度高，可以更精准的测量沙棘及其提取物中原花青素的含量，这对于后续研究具有重要的参考价值。
3、结果可靠： HPLC和核磁共振氢谱法有较高的精度和准确度，可以提供可靠的测定结果，获取准确有效的药效信息，为临床药物的选择和使用提供科学依据。
结论测定沙棘及其提取物中原花青素含量具有重要意义，HPLC和核磁共振氢谱法是最常用的测试方法。
根据研究表明，HPLC和核磁共振氢谱法具有能够提供可靠、准确、有效的测定结果的优点，可以为药物研究提供有效的数据支持，使药效更好地体现出来。
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3．1 原花青素值的测定
原花青素值的测定采用Bates—smith法和Poaer 法。
原理：原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花青素，而儿茶素、表儿茶素等黄烷一3一醇单体没有此反应(图2)。
它们测出的结果是原花青素的相对含量，分别用原花青素指数和PVU表示，是根据经验公式求得的。
葡萄籽提取物中的原花青素指数一般在80～100之间，PVU一般在250～350之间。
原花青素值只是相对含量，并非原花青素的真实含量。
据调查，同为原花青素值95的产品，多酚含量相差15％，质量大相径庭四。
很多生产厂家使用原花青素指数来表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是错误的。
3．2 原花青素含量的测定
原花青素的含量测定方法很多，也比较混乱。
常用的有以下几种方法。
3．2．1 铁盐催化法
此方法的反应原理与原花青素值测定原理相同，在计算原花青素的含量时使用了原花青素标准品。
Fe¨、盐酸为常用的催化剂和酸解剂。
由于水、乙醇为反应介质时吸光值很低，一般采用正丁醇为反应介质【15-161。
通常的具体操作：取1．0 mL 样液(或原花青素溶液)于10 mL刻度试管中，加入6．0 mL正丁醇一浓盐酸(95：5)与2％硫酸铁铵溶液(溶解于2 mol／L 盐酸)0．2mL，混匀，置于沸水浴中加热40min后，立即取出用冰水快速冷却至室温，在550 Nm处测定吸光值。
此方法较简便，而且对原花青素的选择性反应较好。
铁盐催化法对反应体系中的含水量和Fe 浓度要求比较严格，一般要求含水量6％，Fe 浓度4．5x10 ％，而且过高的Fe¨浓度对反应没有影响【l51。
傅武胜【l61 研究表明3％～4％为合适的含水量，Fe 浓度选择在9．OxlO ％左右。
但是也有学者总结分析2％～6％含水量对花青素的形成有抑制作用，稍高的Fe¨浓度(>15 g／L)也抑制花青素的生成.
在铁盐催化反应的基础上，杨大进【l I等人利用高效液相色谱法检测了原花青素含量。
该方法将原花青素在上述铁盐催化条件下生成的深红色花青素离子进行高效液相色谱分析，从而确定原花青素的含量。
此方法能够排除部分杂质的影响，具有定性定量准确的优点。
3．2．2 香草醛法
测定原理：原花青素和儿茶素类单体的A环的化学活性较高，在酸性条件下，其上的问苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩和，产物在浓酸作用下形成红色的正碳离子，样品的浓度与产生的颜色呈正相关，在500 llm波长下测定其吸收光值
香草醛法测定时，一般以儿茶素为标准物，以甲醇为溶剂。
盐酸、硫酸均可作为反应过程的催化剂，但在使用硫酸时，浓度不易过高，过高的硫酸易使香草醛发生自缩合反应和氧化分解。
具体的操作方式较多：1 mL试液+2．5 mL 1％香草醛甲醇溶液+2．5 mL 25％硫酸或8％盐酸(均溶解于甲醇)，30。
【二下反应15 min～20 min【2l。
丑；1 mL试液+6 mL 4％香草醛甲醇溶液+3 mL浓盐酸，室温下反应15 minL231；有的更是在2O℃下反应15 h[241。
操作方式差别较大，不利于使用者的选择，有待于统一。
3．2_3 紫外分光光度法
原花青素为无色物质，在可见光区无特征吸收峰，在紫外区有唯一特征吸收峰，最大吸收波长在280 Nm 处。
尽管此方法简单快捷，但是此方法只适用于原花青素含量纯度特别高的产品，不适合一般原料中原花青素的检测。
这是因为儿茶素类在280 Nm处也有最大吸收，V 、Vc、Ve。
、Ve 、芦丁、B一胡萝卜素等物质在此波长处都有明显的吸收.
3．2．4 Folin—Ciocaheau与HPLC结合法
此方法为美国葡萄籽方法评定委员会推荐使用的方法。
Folin—Ciocaheau法测定的是多酚含量，一般以没食子酸为对照物。
在碱性溶液中，多酚可以将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，在760 Nm处有最大吸收。
葡萄籽提取物中的多酚含量一般在75％～95％之间。
利用HPLC测定没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯四种单体的含量来代表单体的总量。
这是因为它们四种单体的含量占到了葡萄籽提取物中单体含量的90．0％以上。
原花青素的含量则为多酚含量与单体含量相减之差。
此方法缺点是蛋白质、氨基酸、核酸、抗坏血酸等易被氧化的物质也参与Folin—Ciocalteau反应。
同时由于葡萄籽提取物中没食子酸含量甚微(0％～1．2％)，与儿茶素(1．5％～7．3％)和表儿茶素(2．0％～5．1％)含量相差悬殊四，原花青素含量用没食子酸量来表示缺乏代表性。
3．2．5 钼酸铵分光光度法
它是基于邻苯二酚与钼酸铵在弱酸性介质中生成黄色钼酸酯，反应产物在333 nm 波长处具有最大吸收。
马亚军寸检测条件进行了简单摸索：取0．08 mol，L钼酸铵1 mL溶液置于25mL比色管，加人适量试液，用1．OxlO mol／L盐酸冲至刻度，反应瞬间完成。
根据反应原理，花色素、没食子酸、儿茶素类都具有邻苯二酚结构，也参与钼酸酯的生成，测定原花青素的选择性不高，受到杂质影响较大。
3．2．6 其它测定方法
马亚军对原花青素含量测定方法进行了研究：高铁盐一铁氰化钾分光光度法，它是基于原花青素能将Fe 还原成Fe ，Fe 与铁氰化钾生成可溶性深蓝色配位化合物，在710 nm处有最大吸收的原理；硫酸高铈铵分光光度法，它是基于原花青素与Ce“在强酸性介质中反应生成无色的Ce ，Ce“在319 nm波长处具有最大吸收，通过测定黄色高铈盐的吸光度，间接测定原花青素。
另外还有流动注射一抑制化学发光法[271：在碱性条件下，利用原花青素还原H：O：可抑制鲁米诺一H20 体系的化学发光，其抑制的程度与原花青素浓度之间呈线性关系。
这三种方法如同Folin—Ciocaheau法利用多酚的还原性质测定多酚含量的原理，结果都扩大了原花青素的含量。
综上所述，原花青素值的测定只是根据经验公式，并不是原花青素真实含量，与现代检测方法相落伍。
铁盐催化法测定原花青素专属性较强，有很好的应用前景，但仍需要进一步的研究与改进。
香草醛法测定的是原花青素和黄烷一3一醇单体的总量，与HPLC法检测黄烷一3一醇单体：儿茶素、表儿茶素含量相结合起来可以计算原花青素的含量。
但是香草醛法操作方式较多，不利于使用者选择，具体操作方法还需要进行统一。
国外有学者利用HPLC／MS技术分析和检测原花青素，过程比较复杂，技术要求高，不能广泛应用于原花青素产品的测定。
2. 1. 1Bate-Smith法
此方法主要是利用原花青素在热酸性条件下产生红色的物质花青素,葡萄籽提取物中的单体如儿茶素、表儿茶素等没有此反应。
原花青素的含量用原花青素指数(procyanidolic index)来表示,其值一般在80～100 之间,有时也会大于100。
此法测定的是葡萄籽提取物中原花青素的相对含量。