液相色谱基础培训

纸色谱
俄国科学家茨维特以 碳酸钙为吸附剂，分
离植物色素
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卡勒（karrer）、库 恩（Kuhn Richard） 对胡萝卜素和维生素
的研究
Martin和Synge提出 了液液分配理论
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液相色谱系统的组成
HPLC的仪器配置及流程
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
自动进样器
色谱泵
检测器
废液
液相色谱仪设备概述
液相色谱仪器组成
溶剂传输系统（泵系统）
进样系统
工作站
组分收集（选项）
检测器
液相色谱仪的组成
硬件部分
➢输液系统 ➢进样系统 ➢分离系统 ➢检测器
溶剂柜 泵
色谱数据处理系统
柱温箱
脱气机 自动进样器 检测器
检测器
单一或混合溶剂
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梯度洗脱
A A泵
B B泵
进样器 浓度
色谱柱 柱温箱
时间
检测器 33
进样系统
作用：把分析试样有效地送入色谱柱进行分离 要求：进样量重现性好 分类：自动进样器、手动进样器
从泵 到柱
手动进样器
加样
溶剂入口 溶剂出口
样品输入
从泵 到柱
溶剂入口 溶剂出口
进样
样品输入
机械臂
标准自动进样器前视图
进样针
样品环
计量泵
样品盘
六通阀
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标准自动进样器进样过程
1. 六通阀切换到旁路位置 2. 计量泵活塞杆移动至起始位置 3. 抬起进样针 4. 将样品抓至针座上 5. 针扎入样品瓶 6. 计量泵抽取样品 7. 针从样品瓶中拔出 8. 将样品瓶抓离针座 9. 针扎入针座毛细管 10. 六通阀切换到主路位置 11.将样品瓶放回样品盘
Agilent 发布1200 系列液相色谱系统， 取代了之前1100系列
合并收购
赛默飞世尔科技 （Thermo Fisher Scientific）对美国 戴安公司（DIONEX） 提出收购邀约，收购 于2011年完成
丹纳赫
丹纳赫（Danaher） 宣布收购分离科学耗 材制造商 Phenomenex公司， 完善在分析领域布局。
高端检测器
➢光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array,PDA/DAD） ➢质谱检测器（Mass Spectrometry,MS）
检测器使用统计
43.0%
22.0% 10.0%
4.0%
1.0% 5.0% 7.0%
8.0%
UV-VIS DAD Fluorescence Refractive Index Electrochemical Conductivity Mass spec Others
色谱系统
凝胶渗透色谱（GPC) 是1964年，由
J.C.Moore首先研究 成功。沃特世从GPC
进入色谱仪器领域
1972年，Waters推出 用于HPLC系统的
M6000高压泵，并于 1973年Pittcon大会发
布。
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液相色谱发展史---（70年-80年）
➢对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）
整体性质检测器（Bulk property detectors）
➢不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）
液相色谱的检测器
常规检测器
➢示差折光检测器（Refractive Index，RID） ➢紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis,UV） ➢荧光检测器（Fluorescence，FlD） ➢蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering,ELSD） ➢其他检测器（Other Detectors）
法规遵从 支持GXP所要求的工具
软件的确认（Qualification）
支持电子记录
色谱数据处理系统
支持电子签名
常见的CDS软件
1：安捷伦的 OpenLAB 2: 沃特世的 Empower 3：赛默飞的 Chromeleon 4：岛津的 Lab-Solution 5: 日立的 ChromAssist Data Station 6：Clarity软件
LC-VP系列
1997年，岛津推出了 LC-VP系列液相色谱 仪。
液质联用
Waters收购了总部位 于英国曼彻斯特的质 谱技术公司 Micromass，为今后 液质联用技术发展打 下基础。
安捷伦公司
惠普宣布战略性重组 计划，建立一家独立 的测量公司和一家计 算与图像公司，安捷 伦（Agilent）作为 新测量公司的名称。
色谱的主要理论
➢热力学理论
✓以相的平衡观点研究色谱过程 ✓塔板理论为代表 (Martin & Synge)
➢动力学理论
✓以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 ✓Van Deemter 方程为代表
Martin
Synge
分离的原理
样品组分在固定相和流动相之间的分配 ➢流动相带动样品经过色谱柱
2004
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2004
2006
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2010
2016
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02
色谱的分类
固定相：在色谱分离中固定不动、对样品 产生保留的一相。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物 质向一定方向移动的液体或气体。
色谱法的分类 根据流动相的状态将色谱法分成四大类。
表1 色谱法以流动相种类的分类
液相色谱基础知识
售前支持部：尹登刚
青岛盛瀚色谱技术有限公司
Qingdao ShengHan Chromatograph Technology Co.,LTD
目录
1 色谱的发展史 2 色谱的分类 3 液相色谱方法基本原理 4 液相色谱的组成 5 液相色谱发展的现状
01
色谱的发展史
关于色谱
色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式：
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分离系统
包括色谱柱、柱温箱等 色谱柱是一根填满填料的管子 色谱柱的材料有不锈钢、塑料、玻璃等，主要是不锈钢材
质；尺寸（内径、长短）不尽相同； 色谱柱填料主要有硅胶基质和聚合物基质，填料的粒径不
尽相同。
用于HPLC的检测器
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！ HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（Solute property detectors）
色谱类型
流动相
主要分析对象
气相色谱法
气体
挥发性有机化合物
液相色谱法
液体
溶于水或有机溶剂的各 种物质
超临界色谱 法
超临界流体 各种有机化合物
电色谱法 缓冲溶液、电场 离子和各种有机化合物
1.按两相分子的聚集 液相色谱
状态分类
气相色谱
流动相 固定相 类型 液体 固体 液-固色谱 液体 液体 液-液色谱 气体 固体 气-固色谱 气体 液体 气-液色谱
➢医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
色谱分离基本原理 Partition coefficient K分配系数
色谱分离的机理
分离是一个物理的过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
2. 按固定相的固定 方式分类
柱色谱 平面色谱
填充柱色谱 毛细管柱色谱 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱
3.按分离机制分类
分配色谱： 利用分配系数的不同 吸附色谱： 利用物理吸附性能的差异 离子交换色谱：利用离子交换原理 空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同
薄层色谱法和纸色谱法
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HP进入LC行业
惠普（Agilent前身） 收购Hupe & Busch 公司进入LC市场。
分析仪器代工
日本Jasco开始分析 仪器代工生产业务。
戴安公司成立
1975年，戴安公司成 立进入色谱市场（主 要是离子色谱仪）。
岛津进入LC
岛津完成了岛津制高 效液相色谱仪，进入 了LC行业。
1973
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1996
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1996
1997
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1997
1999
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液相色谱发展史（21世纪）
UPLC的推出 Waters推出世界 上首款超高效液相 色谱—— ACQUITY UPLC， 开创UPLC这个新 的品类。
LC-20A推出
岛津推出了全新的 LC-20A液相色谱系 统。
1200系列液相
液相色谱的数据处理及其要求
液相色谱对数据处理最基本的要求 数据的采集
数据的处理
数据的报告
色谱数据处理系统
从基本要求的基础上扩展
一般用户所期望的更多功能 仪器控制
采集二维数据及LC的数据
可靠且强大
色谱数据处理系统
服务与支持
用户培训
从基本要求的基础上扩展
能使用先进的检测方式及特殊应用 光电二极管矩阵源自文库PDA）、质谱（MS）检测 不同领域的应用及其特殊计算
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8
色谱发展史-百家争鸣
层析色谱（TLC)
氨基酸分析
气相色谱理论
色谱速率理论
毛细管气相色谱法
俄国科学家茨维特以 碳酸钙为吸附剂，分
离植物色素
Martin和Synge获得 诺贝尔化学奖
Martin和James提出 了完整的气相色谱理
论
Va n d e e m t e r 提 出 了 色 谱速率理论
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03
液相色谱方法的基本原理
什么是高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography
➢高效液相色谱法，简称：HPLC
是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：
➢高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器……
广泛应用于各个领域：
1975
1975
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1978
11
液相色谱发展史（80-90年代）
HP 1100系列
HP 1100检测仪 是设计用于帮助化 学家加快产品发展 周期(如新药的推 出)和改善分析结 果的质量。
Alliance系列
沃特世Alliance达到 了当时HPLC 仪器所 能达到的最高性能， 并在之后几十年中一 直影响各种HPLC产 品演进。
流动相
➢不同组分与固定相之间相互作用的强度不同 ➢不同组分在固定相上移动速度不同形成分离 分配系数 KD ➢Xm Xs KD1 = [Xs] / [Xm] ➢Ym Ys KD2 = [Ys] / [Ym]
固定相
样品组分的分离
❖ 进样、分配、移动、流出、分离
KD2< KD1 ，所以 Y 先流出來
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3：制药市场一直是沃特世中国的第一大业务体，其 业务量超过50%。近年中国制药市场一直呈两位数 成长。沃特世也为此在中国制药市场投入了更多的 资源，不仅在产品研发上保持创新，在法规依从方 面也一直走在行业前沿。同时，公司在验证服务等 方面也在不断创新和改进，以期更加符合中国市场 的需求。
Golay开创了毛细管气 相色谱法
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色谱发展史-百花齐放
自动氨基酸分析仪
排阻色谱法
Stein和Moore开发氨 基酸自动分析仪
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高效液相色谱
凝胶色谱
HPLC系统商业化
将高压泵和化学键合 固定相应用于液相色 谱，出现了高效液相
➢蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤等等
色谱
是其中一种分离工具
色谱的定义者
• 俄国科学家：M. S. Tswett →
• 正式命名“色谱”的文献 •
➢ 固定相——CaCO3颗粒 ➢ 流动相——石油醚
色带
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色谱发展史-起源
色谱的定义
胡萝卜素分离
诺贝尔化学奖
液液分配理论
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05
液相色谱发展的现状
1：根据仪器信息网调查显示，2018年度中国液相 色谱市场销售总额不到50亿人民币，其中，进口产 品市场占有率超高95%，而安捷伦、岛津、沃特世 和赛默飞市场占有率居前四，占据了绝大部分市场。 2：液相色谱主要以高效液相色谱为主，占90%以上； 超高效液相色谱市场占有率不足10%。
洗脱方式
等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数 目较少，性质差别不大的样品。
梯度洗脱：采用两种（或多种）不同极性的溶剂，在分离过程中按 一定程序连续改变流动相的浓度配比和极性的一种洗脱模式。用于 分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。
等度洗脱
输液泵 进样器
柱温箱 色谱柱
色谱数据处理系统
从基本要求的基础上扩展
色谱数据管理及用户自定义计算、自定义报告 自定义文档字段
用户自定义报告
搜索能力
色谱数据处理系统
排序能力
综合计算
从基本需求的基础上扩展
网络及系统管理能力 配置规模可扩展 灾难防御与恢复 系统安全性 开放结构 存档功能
色谱数据处理系统
从基本需求的基础上扩展