菌种传代与保藏指导书

菌种验收、传代与保藏作业指导书

1.目的

为确保菌种管理的正确操作性，制定本作业指导书。

2.适用范围

适用于实验室各菌种。

3.职责

检验员负责菌种的验收、传代与保藏。

4.内容

4.1定义

标准菌株是指由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。

传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每培养一次即称为一代。所有传代用菌种和工作用菌种的传代次数应严格控制，原则上不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度传代增加菌种变异和污染的风险。

4.2标准菌的来源

标准菌株需有明确来源，应可溯源至国内或国际认可的菌种保藏中心的标准菌株。

4.3标准菌的验收

新购买的标准菌株应检查是否随菌种附有菌种证书。接收时还应检查菌种数量和名称及每一支包装的完整性。在相应的菌种验收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和验收日期等。新购入的标准菌株储存于－20℃冰箱。

4.4菌种的复苏与传代

根据不同的菌种保存方法和保存形式，选择适宜的方法无菌开启菌种。应减少开启过程对菌种活力的影响，且不要引入外部污染。

经冷冻干燥安瓿保存的菌种：先用适宜的消毒剂擦拭安瓿后，用砂轮在安瓿上部1/3处划痕，将安额管顶部烧热，将无菌水滴于加热处使顶部出现裂纹，用无菌器具轻叩裂

纹处上部，开启安瓿管的顶端，用适宜的缓冲液或液体培养基溶解菌块，并转移至新鲜的培养基上培养。

甘油小瓷珠保存法保存的菌种：取出冻存管并用力摇晃，使管内瓷珠分散。无菌条件下拧开冻存管，用无菌的接种环（接种针）或镊子取出1个小瓷珠，拧紧瓶盖。尽可能快地将冻存管放回原来的保存环境，温度过多改变将减弱细菌的生产能力。取出的小瓷珠可以直接放在平板培养基上作划线接种，或者直接置于适合的液体培养基中培养。

斜面低温保存法保存的菌种：从冰箱中取出菌种斜面，放置室温后，移入生物安全柜。点燃酒精灯，把接种环金属部分放在火焰上灼烧，往返通过3次，然后用左手握住培养基试管，将管口靠进火焰旁，右手用无名指、小指及掌部夹住塞子，拨开塞子，用接种环在营养琼脂斜面刮取少量菌苔堵上塞子，左手将菌种管放下，另取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开塞子，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使菌划在斜面的表面上。取出接种环，在火焰旁将培养基管塞子堵上，然后将接种过菌的接种棒在火焰上灼烧灭菌。

4.4.1标准菌株传代

4.4.1.1从冰箱中取出的新购买的标准菌株（一般为第二代，G2），以及灭菌的对应培养基一起移入生物安全柜。按照说明书指示复溶标准菌株，用10μL一次性接种环蘸取菌液，直接接种至平板或液体培养基，置于对应的温度培养，此为第3代（G3）。

4.4.1.2挑取平板上纯菌落按甘油小瓷珠保存法保存，作为保存菌种（G3），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面培养数支，按斜面低温保存法保存，作为工作用菌种，此为第4代（W4）。

4.4.1.3将第3代（G3）瓷珠保存的菌于-20℃冻存，将工作用菌（W4）于适当温度下培养适当时间后在4℃冰箱保存，用于日常检验。

4.4.1.4取冷冻保存的第3代（G3）瓷珠菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成瓷珠菌种保存菌第4代（G4）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后4℃冰箱保存用作工作用菌种，此仍为第4代（W4）。

4.4.1.5将第4代菌种（G4）于瓷珠菌种保存管冻存，将生长、转种后的第3代（G3）菌种经高温灭活处理后丢弃。

4.4.1.6按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新采购标准菌株，重复上述操作，保存和使用菌种。

4.4.1.7当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用

菌种转接下一代工作用菌种。

4.4.2传代用菌种传代

结合菌种的代数和最长保存期限，挑取传代用菌种瓷珠转接平板，按照甘油小瓷珠保存法保存菌种的传代方式传代。

4.4.3工作用菌种传代

当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱 4℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。也可取用瓷珠菌种保存管保存的菌种，进行复苏，斜面培养后直接作为工作用菌种。每隔3个月需转接一次。

4.5培养

把上述接种完的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌置于TSA或TSB培养基30℃～35℃培养18～24h；生孢梭菌置于FTM培养基30℃～35℃培养18～24h；白色念珠菌置于SDA或SDB培养基20℃～25℃培养24～48h。黑曲霉置于SDA 斜面培养基20℃～25℃培养5～7d。

4.6菌种的保存

菌种保存可根据保存目的、菌种特性、保存时间、实验室条件等选择。所保存的菌种应为新鲜培养的对数生长期的纯培养物，但无论应用何种方式保存菌种都应进行验证，确保在相应保存条件下的菌种的活性不会变异且性能稳定。常用的有甘油管冷冻保存法、斜面低温保存法和冷冻干燥法等。

4.6.1传代用菌种的保藏

传代用菌种采用甘油小瓷珠保存法保藏。在无菌条件下，打开冻存管的螺旋瓶盖。用接种环挑取18-24小时新鲜菌纯培养物，放入冻存液中。拧紧瓶盖，来回颠倒使菌乳化，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液。此时菌悬液会吸附在小瓷珠内外表面。用无菌移液器将冻存管中的菌悬液尽量吸出（吸出的菌悬液应放入消毒液中并随后进行高压灭菌处理）。拧紧瓶盖，记录下接种菌的详细情况。将接种完菌的冻存管放在-20℃或-80℃冰箱中保存。

4.6.2工作用菌种的保藏

工作用菌种采用斜面低温保存法保藏。将待保存菌接种在适宜的斜面培养基表面，在适宜温度培养适宜时间，待菌生长充分以后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，转移至4℃冰箱保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和