脐血分离、冷冻和复苏技术
脐带血的使用流程
脐带血的使用流程简介脐带血是新生儿脐带中含有丰富干细胞的血液。
随着干细胞医学的发展，脐带血的应用范围越来越广泛。
本文将介绍脐带血的使用流程，包括采集、处理、存储和应用等环节。
采集脐带血脐带血的采集通常在孩子出生后不久进行，整个过程简单且不会对孩子造成任何伤害。
具体步骤如下：- 选取采集时间：通常在胎儿分娩后的5-10分钟内采集。
- 准备采集工具：包括采集袋、注射器、消毒剂等。
- 消毒脐带：使用消毒剂彻底清洁脐带，避免感染。
- 采集脐带血：将注射器连接到采集袋的导管上，通过轻轻挤压脐带，将脐带血采集到采集袋中。
- 保存脐带血：将采集的脐带血放入特定的容器中，并妥善保存。
处理脐带血采集到的脐带血需要进行处理，以提取和保存其中的干细胞。
具体处理流程如下： - 过滤血液：采用特定的过滤器将脐带血中的红细胞和血浆分离。
- 分离干细胞：采用离心机将血液中的干细胞分离出来，并进行纯化处理。
- 冻存处理：将分离得到的干细胞通过特定的冻存液进行冷冻保存，确保其长期保存的稳定性。
- 样本标识：对每个样本进行标识，确保其可追溯性和正确使用。
存储脐带血处理后的脐带血需要妥善存储，以确保其干细胞的质量和可用性。
存储主要包括以下环节： - 冷冻保存：采用液氮等低温冷冻技术，将脐带血样本保存在极低温度下，避免细胞受损。
- 家庭库存和公共库存：脐带血可选择保存在家庭库存或公共库存中。
家庭库存可以满足家庭成员的需求，而公共库存则可供其他病患使用。
- 监测和管理：存储的脐带血样本需要进行定期的监测和管理，确保其质量和可用性。
脐带血的应用经过存储，脐带血可在需要时进行应用。
脐带血的应用主要包括以下几个方面：- 干细胞移植：脐带血中含有干细胞，可用于干细胞移植治疗一些血液系统疾病，如白血病、骨髓衰竭等。
- 组织工程学：脐带血中的干细胞可用于生物材料的制备，用于修复组织和器官。
- 科研用途：脐带血中的干细胞可用于科研研究，有助于深入探究干细胞的特性和潜能。
脐血造血干细胞分离方法的实验研究
脐血造血干细胞分离方法的实验研究作者：王永娟来源：《科学与财富》2018年第18期摘要：脐血作为一种造血干细胞来源可替代骨髓进行造血干细胞移植，脐血移植在治疗儿童遗传性疾病和血液病方面取得了巨大的成效。
为进一步推广脐血移植，必须相应地建立起完备的脐血库。
脐血库不同于骨髓库，它必须冻存实物。
为减少冻存体积，降低成本，需要采取有效的方法分离脐血中有核细胞，从而使大规模、广泛地建立脐血库成为可能。
本文对脐血造血干细胞分离进行实验研究分析。
引言脐带血（umbilical cord blood，UCB）是产后留存在胎盘和脐带中的血液，以往被作为医学废物而丢弃。
近十几年的研究发现，人脐带中存在大量间充质干细胞，间充质干细胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成体干细胞的一种，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，可以重建人体造血和免疫系统的造血干/祖细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。
一、试验方法1.1脐带血造血干细胞分离利用离心沉降法和自然沉降法分离脐带血有核细胞，计算有核细胞回收率和红细胞回收率，比较两种分离方法的分离效果。
离心沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1∶5的比例混合，慢速摇匀10min，以50g、10℃离心7min，收集上层富白细胞血浆，再以400g、10℃离心15min，去除血浆。
自然沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1：5的比例混合，慢速摇匀10min，悬挂让其内细胞自然沉降1h后，收集上层富白细胞血浆，同样以400g、10℃离心15min，去除血浆。
1.2脐带血造血干细胞冻存将分离后的脐带血分别与4种不同的冷冻保护剂混合，脐带血与冷冻保护剂的体积比为4∶1，混合时应将冷冻保护剂缓慢注入脐带血中，边注入边晃动。
用程控降温仪按以下程序降温，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降温至-40℃，再以-10℃/min的速率降温至-80℃，完成后将脐带血混合物放入液氮罐中储存。
NK细胞无血清培养套装使用说明书——脐血2L体系
NK 细胞无血清培养套装使用说明书——脐血2L 体系【适用范围】【试剂准备】【使用步骤】【产品组成】【脐血PBMC 分离】用于脐带血体外诱导扩增NK 细胞。
如用采血袋采集，由于采血袋中含有抗凝剂，务必保证血样净含量50mL （不包括抗凝剂体积），否则在接种细胞时细胞的总数量达不到接种要求，最终收获不到理想细胞数。
2L 培养体系套装：适用于50mL 脐带血的样本量，使用2L 培养基。
分离单个核细胞前，应将脐血、PBS （生理盐水）和淋巴细胞分离液室温平衡至20℃。
将脐带血平均分装到50 mL 离心管中，于室温下700g 离心15 min （离心机升速8，降速4）， 取上层淡黄色血浆至新的50mL 离心管中（下层红色液体用于提取单个核细胞），于水浴锅中 56℃灭活30min ，然后900g 离心10min ，取上清，置于-20℃，15min ，再次900g 离心10min ， 取上清，置于4℃保存。
（900g 离心时离心机的升降速均调节至最高即可） 1. 第0天T175培养瓶包被:先将15mL PBS 加入T175瓶中，再将一支YC00A 添加于T175瓶中，充分混 匀后，37℃孵育2h ，弃去上清，并用15mL PBS 清洗一次,弃清洗液后备用。
接种45mL 培养 基A ，细胞密度2-3E6/mL ，添加诱导因子一支YC00B ， 添加10%比例的自体血浆。
2. 第3天补加100mL 培养基B ，添加5%的自体血浆，动作轻柔、不可将贴壁细胞晃起。
3. 第5天补加150mL 培养基B ，添加1%的自体血浆，分成两个T175进行培养，分瓶时轻轻将底部细胞 团吹起，单个的贴壁细胞不用过度吹打。
4. 第7天补加300mL 培养基B ，添加1%的自体血浆，轻轻地将细胞团晃起后把所有细胞转移至细胞培 养袋，原瓶中各添加50mL 新鲜培养基B 。
原瓶中的单个贴壁细胞不用过度吹打。
(1) 取上一步血浆提取中得到的下层红色液体用生理盐水1：2稀释，混匀，备用。
脐带血干细胞库工艺流程和质量控制
脐带血干细胞库工艺流程和质量控制下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!脐带血干细胞库的建立是为了保存新生儿脐带血中的干细胞，这些干细胞具有自我更新和多向分化的能力，可用于治疗多种疾病。
干细胞提取与保存的技巧与方法
干细胞提取与保存的技巧与方法干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型的细胞，具有巨大的潜力在医学和生物学领域中应用。
干细胞的提取和保存是关键的步骤，本文将介绍干细胞提取和保存的技巧与方法。
一、干细胞提取的技巧与方法1. 骨髓提取法：这是一种常用的干细胞提取方法。
通过无痛穿刺骨髓髓腔，将骨髓液抽取出来。
在抽取骨髓液之前，患者通常接受麻醉以减轻不适感。
骨髓液中富含造血干细胞，是一种常见且具有较高干细胞含量的来源。
2. 脐带血提取法：脐带血也是一种常见的干细胞来源。
在新生儿出生后，由医生采集脐带血样本。
脐带血中的干细胞数量较多且易于提取，因此被广泛应用于临床治疗。
这种方法对于新生儿和脐带血样本的采集具有一定要求，需要专业的医生或护士进行操作。
3. 脂肪组织提取法：越来越多的研究表明，脂肪组织中也存在干细胞。
通过脂肪吸取手术，可以从脂肪组织中提取干细胞。
脂肪组织中的干细胞具有较高的分化潜能和自我更新能力，因此被广泛研究和应用于再生医学。
4. 神经组织提取法：对于神经组织相关的疾病研究，干细胞的提取通常需要从神经组织中进行。
这种方法通常需要进行手术操作，因此对于患者和医生来说都具有一定的风险与挑战。
但是，神经组织中的干细胞对于神经系统疾病的治疗具有重要意义。
二、干细胞保存的技巧与方法1. 冷冻保存：这是最常用的干细胞保存方法之一。
在提取干细胞后，将其以低温冷冻储存。
一般情况下，干细胞在-196℃的液氮中冷冻保存，以确保其长期保存和保持其功能。
在冷冻保存过程中，需要特殊的冷冻冻存液和冷冻设备，操作时需小心谨慎，避免细胞损伤。
2. 固体冻干法：这是一种相对较新的干细胞保存方法。
干细胞在低温下冷冻后，通过冻干设备将水分从细胞中去除，然后将细胞以固体形式保存。
这种方法可以避免细胞在冷冻和解冻过程中的冰晶损伤，并能够长期保存细胞的活性。
3. 混合保存法：有些干细胞存储公司提供混合保存的方法，即将干细胞保存在液氮中冷冻，并同时保存一小部分细胞的活体状态。
高中生物学教学中的生命科学前沿问题
高中生物学教学中的生命科学前沿问题【摘要】我国新一轮课改也适当加大了前沿生物知识的比重，在确保基础性的前提下，对教学内容进行了一定的扬弃。
如何让生命科学前沿知识更好的服务高中生物教学，如何把握前沿知识和基础知识的过渡和衔接，如何通过前沿知识向学生传达生物科学的研究方法和思考方式，更好的服务基础知识的教学，是每个生物教师都在思考的问题。
【关键词】高中生物、生命科学前沿问题、生命科学、教学方法1.新课标中对高中生物中生命科学前沿问题重视新课程标准在基本理念、课程目标、课程内容、课程评价、教学建议等方面都有了较大变化，同时在教学的内容要求上也有了较大的突破，新课改的理念之一就是“注意学科渗透，关心科技发展”，新增内容的教学要求虽不高，却有助于弥补生物教学长期存在的不足。
我国新一轮课改也适当加大了前沿生物知识的比重，在确保基础性的前提下，对教学内容进行了一定的扬弃。
1.高中生物课本中的生命科学前沿问题发展现状1.干细胞研究成体干细胞在维持正常组织结构与功能以及组织器官的再生等方面发挥重要作用。
目前的许多研究已证明在衰老过程中成体干细胞将发生功能上的改变。
近年来，关于成体干细胞中表观遗传修饰对机体衰老的调控已逐步得以阐明。
在衰老过程中，DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA等表观遗传机制如何协同调控干细胞的功能是今后亟待深入探讨的课题。
由于表观遗传具有可逆性和可遗传性，处于衰老环境中的成体干细胞受环境影响产生的表观遗传变化极有可能传递到子细胞中。
延缓或逆转衰老特异表观遗传修饰或许是实现干细胞和机体衰老延缓及逆转的重要突破口。
我国现已掌握了脐血干细胞分离、纯化、冷冻保存以及复苏的一整套技术，并开始在上海筹建我国第一个脐血库。
在北京，北京医科大学人民医院细胞治疗中心也正在筹建全世界最大的异基因脐带血干细胞库，计划到2002年完成冷冻5万份异基因脐带血干细胞，为全世界华人患者提供脐带血干细胞做移植用。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析所谓造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC，）是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。
它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞,同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
图1 造血系统和造血干细胞分化图Fig。
1 hematopoietic system and hematopoietic stem cell differentiation.造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增殖潜能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。
造血干/祖细胞鉴别的传统方法还是应用集落分析方法，它可检测粒-巨嗜细胞集落形成单位（colony - forming unit-granulocyte/ macrophage，CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-MK）、红系-粒系-巨嗜系-单核系集落形成单位（multipotent colony-forming units，CFU-GEMM或mixed colony-forming unit，CFU-Mix），等等，它是在半固体培养基上培养14天，然后在显微镜下计数集落。
造血干细胞的表面标志随着个体发育的不同时期不同，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-已经普遍被认为是造血干细胞的标志。
此外，1997年发现一个新的造血干细胞标志是AC133，但具CD34抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共同标志。
细胞复苏的操作方法有哪些
细胞复苏的操作方法有哪些
细胞复苏的操作方法主要包括以下几种：
1. 冷冻保护：将细胞以液氮的温度封存起来，防止细胞死亡。
2. 细胞培养：将被冻存的细胞移植到培养基中，提供所需的营养和环境，使其恢复生长。
3. 细胞激活：添加药物、激素等化合物，促进细胞的分裂和生长。
4. 离心：通过离心的方式，使细胞重新沉积，减少细胞损伤。
5. 溶解解冻：在特定的温度、时间和浓度条件下，缓慢地将细胞解冻，并以适当的速度加入培养基中。
6. 细胞转染：将外源基因转移入已复苏的细胞中，促进其分裂和生长。
细胞复苏的方法因不同的细胞类型、存储条件和复苏目的而异。
脐血干细胞的特性及其临床应用_田晓宁
中国组织工程研究与临床康复第 13 卷 第 36 期 2009–09–03 出版September 3, 2009 Vol.13, No.36Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research学术探讨脐血干细胞的特性及其临床应用★田晓宁Characteristics and clinical application of umbilical cord blood stem cellsTian Xiao-ningAbstract: Umbilical cord blood that is rich in hemopoietic stem cells and mesenehymal stem cells is collected in vivo and in vitro.Reclamation of stem cells plays an important role in processing umbilical cord blood; additionally, separation of monocytes also plays an important role in establishing bank of umbilical cord blood and performing umbilical cord blood stem cell transplantation. Umbilical cord blood is separated using density gradient centrifugation, hydroxyethyl starch settling process, monoclone antibody flow cytometry, and immunomagnetic bead sorting. Density gradient centrifugation combined with adherent method is used to in vitro separate and culture mesenehymal stem cells; bio-reactor is used to amplify human umbilical cord blood stem cells and progenitor cells. Under a certain condition， mesenehymal stem cells are able to differentiate into hepatocytes. Cryopreservation is mainly used to freeze umbilical cord blood. Vitrification method characterizes by sample, rapid, and high effective, thus it is an ideal method to maintain umbilical cord blood stem cells for a long term. Umbilical cord blood stem cell transplantation benefits for treating various diseases in clinic. Tian XN.Characteristics and clinical application of umbilical cord blood stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36): 7197-7200. [ ]Department of Gynecology, Nangang Branch, the Second Hospital of Heilongjiang Province, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China Tian Xiao-ning★, Master, Associate chief physician, Department of Gynecology, Nangang Branch, the Second Hospital of Heilongjiang Province, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China lvcha1234@ Received: 2009-07-24 Accepted: 2009-08-10摘要：脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞，脐血采集有体内采集法和体外采集法两种方法。
脐带血分离protocol
脐带血分离protocol2012-3-17 更新密度梯度离心1.估算脐血样本的体积并做相应标记；2.脐带血单个核细胞计数：10μL脐血+190μL3％冰乙酸（稀释20倍），计数板计数细胞，得出浓度和有核细胞总数；3.若脐血浓度为≦1×107个/ml，不用稀释，否则用PBS溶液稀释脐血浓度至约1×107/ml；4.颠倒几次充分混匀Ficoll-PaguePREMIUM，用移液枪吸取Ficoll-PaguePREMIUM 15ml至50ml离心管内；5.小心将30ml稀释的血样品加到Ficoll-PaguePREMIUM上(滴加血液时一定要轻柔，避免加入的血液与Ficoll液相混合,确保二者分层清晰）；6.离心：400g，30min，200C，↗Max ↘Slow；7.用吸管将单个核细胞层移到无菌的离心管中（离心后分为四层,从上至下依次为:血浆、单个核细胞层、Ficoll、红细胞与多核细胞，注意此时要轻拿轻放，切勿将已分层的液体重新混合。
吸取少量血浆不会影响结果，但需避免吸入大量Ficoll）单个核细胞计数并留样1.将收集的单个核细胞均分至新的50ml离心管中，每管10ml,加3倍（30ml）平衡盐溶液PBS,混匀后离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；2.先用1mlACK充分重悬，再补加9mlACK，混匀后室温静置10min，添加PBS溶液至50ml，上下颠倒混匀；3.离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；4.先用1mlPBS充分重悬，再补加9mlPBS，并对单个核细胞计数：10μL细胞悬液+90μL台盼蓝（即稀释10倍，稀释后立即计数）；5.用无菌进口1.5mlEP管保存脐血筛查用细胞（标注日期、脐血编号），每袋血样留2份样本，每份4×106个；6.离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；磁珠分选1.a)若细胞总数＜2×107 ，用100μL磁珠buffer 重悬细胞；b)若细胞总数为2×107 ～2×108，用磁珠buffer将细胞重悬到终浓度为2×108个/ml；c)若细胞总数为2～5×108，用1ml磁珠buffer 重悬细胞；2.以100μL/ml细胞悬液的比例添加EasySep Positive Selection Cocktail（e.g.1ml细胞悬液添加100μL Cocktail），混匀细胞，室温静置15min；3.以50μL/ml细胞悬液的比例添加EasySep磁珠，用枪头上下吹吸至少五次使溶液混匀（切记不要vortex）；室温静置10min；4．添加磁珠buffer使细胞悬液总体积为2.5ml，用枪头上下吹吸2～3次混匀，然后将细胞悬液转移至流式管中，，并在管壁上标注2.5ml刻度线。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
建立脐血库关键技术──脐血分离、冷冻和复苏技术
研究进展
提要胎儿脐血作为造血干细胞的一个新来源，具有富含CD34+细胞等造血干/祖细胞，增殖速度快，来源充足，收集安全等优点；脐血移植同样具有安全性好，效率高，费用低等优势。
随着脐血干细胞移植临床应用的成功，欧美许多发达国家已着手建立大规模脐血库以满足临床需求。
由于脐血库液氮保存细胞费用昂贵，技术上要求预先分离脐血单个核细胞以减少冻存体积。
同时还需要改善细胞冷冻保护剂组成，控制降温速率和细胞复苏方法，以获得理想的脐血干/祖细胞收率，满足临床需求。
0 引言
造血干细胞移植现在已被确证为能治疗一系列恶性和遗传性疾病（包括白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血、乳腺癌等），也能为经受高剂量化疗或放疗的病人维持和恢复髓系的造血功能［1］。
胎儿脐血已被认为是除骨髓和外周血以外又一个理想的造血干细胞资源，具有来源充足；造血干/祖细胞更原始，细胞增殖速度快; 收集安全等优点。
脐血移植相对于骨髓移植而言，具有不易患移植物抗宿主病(GVHD)和病毒感染（如巨细胞病毒、艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等），供体寻找时间短，效率高、费用低等优势。
1989年Gluckman等［2］首先报道了利用HLA匹配脐血移植治疗Fanconi贫血的成功病例。
1994年Kurtzberg等［3］报道了HLA非匹配脐血移植的成功病例。
随着临床试验的成功，近年来，脐血移植已经愈来愈受到了国内外学者的广泛关注，脐血移植病例数量增长迅速，至1997年底已经达到500多例［1］。
为了完成脐血移植的上述临床治疗目标，迫切需要建立脐血库来满足研究和临床需要。
九十年代开始，美国纽约首先建立了世界上第一个大规模脐血库，不久以后欧洲的许多国家也相继开始了各自的建库工作［4］。
在脐血库建立过程中，脐血样本处理技术是其中的关键，其核心技术是减小脐血样本冻存体积，提高造血干/祖细胞纯度及其冻存复苏后的收率和活性维持。
1 脐血分离技术
虽然每份脐血平均采集量只有100ml左右，但由于脐血库液氮设备及平时维持费用昂贵，因而需要从脐血中去除红细胞、血小板和血浆，主要收集富含脐血干/祖细胞的有核细胞(NC)，通过浓缩和纯化达到缩小脐血保存体积以满足实际建库要求。
早期的脐血细胞分离方法常会导致造血干/祖细胞的丢失［5］。
有学者［6］对1.077g/L淋巴细胞液（Ficoll）、Percoll溶液密度梯度离心分离、NH4Cl溶解法、甲基纤维素、3%明胶、6%羟乙基淀粉（HES）沉降等不同分离方法的分离效果进行了详细的分析和比较，发现3%明胶沉降的分离效果最好，其CD34+ 细胞回收率和集落（ CFC）回收率最高，分别达到86%和92%；溶解法次之，但由于其终体积较大，无实际应用价值；Ficoll和Percoll密度梯度离心法，虽然应
用较广泛，但其对技术要求较高且费用相对较贵；HES和甲基纤维素的回收率较低，一般不超过60%。
Dondlson等［7］也得出了用3%明胶两次沉降可以获得较高
的CFC和CD34+收率的结论，同时他提出DNA酶(DNAase)在血细胞分离时对解决细胞结团现象有所帮助。
最近，Bruno等报道［8］用6%HES（溶于0.9%NaCl ）两
次沉降脐血可以获得与明胶沉降相当的高回收率（NC 92.9%, CD34+ 90.5%, CFU-GM 83.8%）。
降低HES浓度不会改善细胞结团现象，相反在低于4%的情况
下不能在细胞冻存时起到保护剂的作用。
DNAase可以改善细胞结团现象，但是
在临床上会增加病人患过敏和热反应的危险。
早期的脐血分离操作方法均为开放式，步骤较为繁琐，容易造成污染，于是有学者对在封闭系统下分离脐血细胞进行了研究。
有报道采用二步梯度离心法［9］，即用三联血袋在不同离心力下，分两步分别去除红细胞和血清，可以获得白细胞(WBC)72%和CD34+细胞87%的较理想回收率，同时达到减少59%红细胞和56%原血体积的目的。
此后Ademokun等［10］的密度梯度离心分离研究获得了NC90%, 祖细胞88%，CD34+细胞100%的高收率，但是该方法脐血样本终体积较大，平均每份44ml。
采用封闭式梯度离心分离技术，红细胞去除率较低，样本体积过大，而沉淀法相对而言，具有可以控制最终细胞冻存体积的优势。
比较明胶和HES这两种沉淀剂，由于明胶熔点较高，在细胞冷冻后复苏时不易溶解，在脐血库实际操作上存在一定缺陷。
而HES来源便利，且在临床上可以直接注入病人体内，因而在脐血样本冷冻时被广泛应用。
Rubinstein等［11］创建的脐血细胞分离方法，在三联
袋封闭状态下，用终浓度1.2%的HES对脐血细胞进行沉淀分离，在确保有效回
收脐血NC、CD34+和CFU-C的前提下，将每份脐血样本终体积控制在20～25ml
左右，从而可以大大节省冷冻空间和脐血库长期维持费用。
目前该方法的实用性和有效性已在世界范围内被广泛接受，并被应用于欧美等国的脐血干细胞库建设。
2 脐血细胞冷冻复苏技术
脐血干细胞冷冻可以全血冷冻，也可以采取NC分离后冷冻的方法，鉴于大型脐血细胞库要求冻存体积小、细胞回收率高的特点，一般采用后者。
Turner等［12］分别采用沉淀法，Ficoll和Percoll密度梯度溶液分离冷冻
后的脐血，经过5周长期培养，祖细胞集落的回收率能够达到CFU-GM 82%，BFU-E 94%，CFUs 90%。
在液氮保存6年后仍能获得较高的造血干/祖细胞回收率并保持其活性。
Almici等［13］近来的研究表明，在冻存了6个月之后NC活性和干/祖细
胞集落形成能力仍能保持在原来的80%以上，证明低温冷冻保存对于干/祖细胞
的体外增殖能力和活性维持不会有显著影响。
2.1 冷冻保护剂的选择
二甲基亚砜（DMSO）作为常用的细胞冷冻保护剂，也已被应用于脐血冷冻。
由于其本身对细胞具有毒性，因而在应用中浓度要求尽量低。
鉴于血细胞耐受力差的特性，Rubinstein等［11］采用10%浓度的DMSO冻存脐血细胞，获得了NC和
祖细胞收率90%以上，细胞活性60%以上的较为理想的冻存结果。
Dondlson等人［7］的研究发现，5%～10%的DMSO浓度对于脐血细胞活性和CD34+细胞的收率影响并不显著，他们建议在脐血细胞冷冻时采用7.5%DMSO为宜。
不久以后，Bruno
等［8］分析比较了10%DMSO和5%DMSO+6%HES冷冻脐血细胞的效果，结果发现NC
和CD34+细胞回收率以及细胞活性等各项指标几乎相同。
此结果表明，HES可以
起到一定的冷冻保护剂功能，从而达到减少DMSO浓度的目的。
由于在外周血和骨髓干细胞冻存复苏后发生结团现象，而HES的加入会在一定程度上加剧这一现象。
Richter等［15］的研究结果可以解除上述担心，他们采用5%DMSO和自体血浆，而不用HES，脐血细胞冻存复苏后的收率仍达到86%。
目前由于该方法经济简便，且细胞回收率高，因此已被应用于大型脐血库建设。
此外，许多研究报道［11-13］认为除了DMSO之外，在脐血冻存时还需加入浓度不等的胎牛血清(FCS)或葡聚糖40 (Dextran 40)和人血清白蛋白(HSA)等辅助保护剂，改善渗透压，以进一步保护细胞在冷冻复苏过程中不受损伤。
2.2 细胞冷冻速度和复苏方法
脐血细胞冻存复苏遵循慢冻速融的原则，冻存的基本步骤包括：制备细胞冷冻液→0℃冰水浴→－80℃控温冰箱→－196℃液氮保存。
Watts等［16］在关于外周血干细胞冷冻的研究中，发现当细胞冷冻的降温速率大于9℃/min时，CFC-GM的产率要比降温速率小于2℃/min时低50%。
Dondlson 等［7］的研究表明在脐血细胞冷冻中同样存在上述现象，当细胞冷冻降温速率控制为1℃/min时，其CD34+细胞收率要较5℃/min和10℃/min时高得多。
脐血细胞样本复苏时，在37℃水浴中，2分钟即可熔融。
由于DMSO对细胞具有毒性及其高渗透压的特性，细胞复苏液需要离心以去除悬浮液中的DMSO。
如果未经处理即进行上述操作，会导致大量细胞失去活性，甚至死亡。
因而在细胞样本刚刚融化时，需要加入适量的保护剂，来稀释溶液，调节渗透压，达到保护细胞的目的。
Rubinstein等［11］的研究表明如果脐血细胞在复苏后不及时去除DMSO，会导致NC活性降低25.5%，祖细胞活性降低39%。
因而他们采用2.5%HSA 和5%Dextran 40等量稀释细胞样本，获得了较佳效果。
Kogler等［17］的报道则比较了5%Dextran 40 + 2.5%HSA和50%FCS + RPMI-1640的复苏效果，结果前者的CD34+细胞收率和CFC产率要比后者高出10%以上。
3 小结
综上所述，在封闭状态下采用6%HES处理脐血样本，获得富集造血干/祖细胞的NC的方法，可使脐血冷冻样本体积减少至20～25mL左右；细胞冷冻时采用5%～10%浓度的DMSO作为保护剂，同时添加一定浓度的FCS或Destran 40和HSA，降温速率控制在1～2℃/min为宜；细胞复苏时，在37℃水浴熔解后，需添加Destran 40和HSA稀释样本，然后离心去除DMSO等处理过程后，可望获得较高的干细胞收率和活性。