水稻转基因实验操作手册整理
水稻转基因组织培养步骤
水稻转基因组织培养步骤农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4?7H2O 3.7gCaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。
实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
水稻、玉米、油菜转基因产品内标准基因检测方法及标准化
水稻、玉米、油菜转基因产品内标准基因检测方法及标准化下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立
转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立一、背景介绍Bt汕优63是一种经过基因工程技术改造的转基因水稻品种，通过引入Bt基因，使其具备抗虫特性，有效减少农药使用，保障粮食安全。
为确保Bt汕优63中外源基因插入结构的稳定性和表达量，本研究旨在建立一套针对其外源插入结构的验证和定量检测方法。
二、外源插入结构验证方法1. DNA提取从Bt汕优63植株中提取基因组DNA，作为后续实验的模板。
2. PCR扩增设计特异性引物，针对Bt基因及其侧翼序列进行PCR扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证Bt基因是否成功插入水稻基因组。
3. 序列分析将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，确认插入位点和序列的正确性。
三、定量检测方法建立1. 实时荧光定量PCR（qPCR）以Bt基因为目标，设计特异性引物和探针，建立qPCR检测体系。
通过标准曲线法对Bt基因在水稻基因组中的表达量进行定量分析。
2. qPCR实验步骤（1）制备cDNA：以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA。
（2）配制qPCR反应体系：包括cDNA模板、引物、探针、dNTPs、Taq酶等。
（3）设置qPCR反应程序：包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。
（4）数据分析：采用软件分析Ct值，根据标准曲线计算Bt基因的相对表达量。
四、方法优化与验证1. 优化实验条件：对qPCR反应体系中的引物浓度、探针浓度、退火温度等进行优化，确保检测体系的灵敏度和特异性。
2. 重复性实验：进行多次独立实验，验证检测方法的重复性。
3. 线性范围验证：通过制备不同浓度的标准品，构建标准曲线，验证检测方法的线性范围。
本研究成功建立了Bt汕优63外源插入结构的验证和定量检测方法，为后续转基因水稻的监管、研究和应用提供了有力的技术支持。
通过这些方法，可以确保Bt汕优63中外源基因的稳定性和表达量，为我国转基因作物的发展和安全提供保障。
六、实验操作注意事项1. DNA提取过程中的注意事项确保实验过程中使用的器械和容器无菌，避免DNA污染。
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)说明使用表型观察、PCR法鉴定转基因水稻的条件1. 引言转基因技术的广泛应用使得转基因作物的鉴定成为农业领域中的重要任务之一。
其中，转基因水稻鉴定对于保障粮食安全、推动农业可持续发展具有重要意义。
本文将针对使用表型观察和PCR法鉴定转基因水稻进行详细介绍。
2. 表型观察鉴定转基因水稻的条件转基因水稻的表型观察鉴定通常需要以下条件：•生长环境：转基因水稻和非转基因水稻应在相同的生长环境下进行观察，包括温度、湿度、光照等因素。
确保生长环境的一致性有助于排除其他环境因素对水稻表型的影响。
•对照品种：选择与待鉴定水稻表型相似的非转基因水稻对照品种，用于对照比较观察结果。
这有助于辨别转基因水稻的特异表型特征。
•观察时间点：需要在适当的生长阶段进行观察，以确保转基因水稻的表型特征能够明显表现出来。
通常，在水稻植株出苗、分蘖、开花等关键生长阶段进行观察效果较好。
•观察指标：通过观察转基因水稻在相关生长阶段的形态特征、生理指标等来判断其是否为转基因品种。
例如，观察水稻株高、叶片形态、穗长等指标的变化情况。
3. PCR法鉴定转基因水稻的条件PCR法是一种常用的转基因鉴定方法，也可用于转基因水稻的鉴定。
下面是鉴定转基因水稻所需的条件：•提取基因组DNA：利用合适的DNA提取方法，从待鉴定水稻样品中提取基因组DNA。
确保提取的DNA质量和浓度适宜，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
•选择适当的引物：根据需要鉴定的转基因特征，选择适当的引物。
这些引物应与目标转基因序列具有特异性，以确保可靠的扩增结果。
•反应体系设计：根据引物设计PCR反应体系，包括适当的引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度等。
并设置负对照和阳性对照，以确保实验的准确性和可靠性。
•PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，包括反应温度、反应时间、循环次数等。
根据引物的特性和PCR仪的要求进行合理调节，确保PCR反应能够成功扩增目标序列。
水稻转基因组织培养步骤
农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因实验操作手册整理
水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。
预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。
乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌（工程菌）培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。
3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。
分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
水稻转基因策略-第三版
水稻转化体系的构建（第三版，2015年3年10日）N6D 诱导愈伤，前培养2N6-AS 共培养N6DS 筛选MS-NK 再分化MS-HF 生根AB 农杆菌生长MSL 侵染N6D 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min2N6-AS 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gCasamino acid 0.3gSucrose 30gGlucose 10g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml AS（200mg/L）不要吹的太干，该培养基要湿度高一些较好。
N6DS 1LChu N6Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-NK 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Casamino acid 2gSucrose 30gSorbitol 30gNAA 0.02mg/LKinetin 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-HF 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Sucrose 30gGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃AB 200mlGlucose 1gAgrose 3gAB Buffer(20倍) 10mlAB Salt (20倍) 10mlddH2O 180ml120℃15min 冷却至50℃加相应的抗生素。
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水稻转基因实验操作一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。
预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。
乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、农杆菌（工程菌）培养把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。
在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。
3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。
分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
19-20℃（组培室）暗培养3天。
五、愈伤组织的抗生素筛选将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗4次，然后加入无菌水浸泡10min,使愈伤内部的菌体游离出来；倒去洗液，再用含400mg/L头孢的无菌水浸泡20min。
再用含400mg/L头孢的无菌水冲洗一次，最后置于无菌滤纸上沥干3h。
第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含400 mg/L羧苄青霉素（Car）和400 mg/L头孢霉素的选择培养基（没有选择压力）上，26℃暗培养5-7天；然后将愈伤转到含400mg/L羧苄青霉素（Car）、400 mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的培养基上进行选择，26℃，暗培养，两周一次，培养两次。
六、抗性愈伤组织的诱导分化和生根1）将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，26℃，暗培养5-7天。
2）预分化培养的抗性愈伤转入分化培养基（改用三角瓶或者平底试管）26℃，2000Lx 光照培养，再生转基因植株。
3）待小苗长到3-5cm;转入生根培养基上发根。
4）将根系健壮的植株移入盆砵，凉棚过渡3-5天；然后移到自然条件下生长，直至成熟。
注：分化过程中不可将愈伤继代培养，转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。
将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。
以上操作步骤皆在无菌条件下进行。
七、转化苗的检测验证1）GUS检测：将准备好的材料浸泡在染液里，37℃保温过夜。
GUS染液成分见附录。
2）GFP检测：将材料放在共聚焦显微镜下观察成像。
3）PCR检测：设计潮霉素抗性基因引物HYG-F 5` CTTCTGCGGGCGATTTGT 3` HYG-R 5` CAGCGTCTCCGACCTGAT 3` PCR 反应条件为：95℃变性5min，55℃退火2min，72℃延伸2min，72℃保温10min。
反应结束后，PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
4）潮霉素快速检测转基因幼苗的方法（具体见附录）。
附录：各种母液及培养基的配制方法一、激素的配制激素溶解方法母液浓度6-BA; KT100mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再用蒸馏水定容100mL；4℃保存1 mg/mlNAA; IAA100mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再用蒸馏水定容100mL；4℃保存1 mg/ml2，4-D 2,4-D 100 mg加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容100mL; 4℃保存1mg/mlAS 0.196g AS加10mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，用1.5mleppendorf管分装成小份-20℃贮存。
配制时注意带乳胶手套操作。
100mM1）抗生素链霉素（Str）50mg/ml：溶解0.5g链霉素硫酸盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
利福平50mg/ml：溶解0.5g利福平于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存壮观霉素（Spec）125mg/ml：溶解1.25g壮观霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
羧苄青霉素（Car）400mg/ml：溶解4g羧苄青霉素二钠盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
头孢霉素400mg/ml：溶解4g头孢霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存卡那霉素（Kan）50mg/ml：溶解0.5g卡那霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。
二、各类基本培养基成分表：1）有机母液储存液（4度保存）：B5 有机工作液为从序号为1、2、3 各取1mL；序号4取10 mLMs 有机工作液从序号为1、2各取0.5mL, 3取40μl；4取10ml;5取1mlN6 有机工作液从序号为1、2各取0.5 ml ,3取100μl；4取10ml;5取1ml2）铁盐配制（4度保存）：注：配制顺序如下1.称取2.78g FeSO4·7H2O溶解于200ml去离子水中（A）。
2.称取3.73g Na2-EDTA·2H2O溶解于200 ml去离子水中（B）。
3.将B置于70℃水浴锅中直至溶质完全溶解（C）。
4.将A倒入C中混合，置于70℃水浴锅中保温2h。
5.定容至1L。
三、农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：酵母提取物1g蛋白胨10g蔗糖5gMgSO4·7H2O 1.027pH 7.0-7.4灭菌结束后加抗生素至终浓度为：利福平50mg/L壮观霉素（Spec）125mg/L四AA培养基储存液(室温储存)微量元素配制中Na2MoO4·2H2O 单独溶解后与其他物质混合后定容到1L,室温保存。
3）水稻苗期水培营养液配方：注:1．制备大量元素营养液母液时，各种盐类分别溶解，分别储存，使用时每升营养液加1mL 母液。
2．制备微量元素营养液（除Fe外）时，先放500mL去离子水，称取各种盐类逐一溶解后，入容量瓶加蒸馏水稀释至1L，制成母液，使用时每升营养液加1mL母液。
3．Fe的制备：溶解5.57g FeSO4·7H2O于200 mL蒸馏水，再另溶解7.45g Na2-EDTA 200mL 蒸馏水中，加热Na2-EDTA（大约70度），加入FeSO4·7H2O，不断搅拌，然后于70度恒温箱中螯合2h，冷却定容至1L，储于棕色瓶中，使用时每升营养液加1mL母液。
4．调节pH为5.5。
5．铵营养时，加入硝化抑制剂（双氰胺），每升营养液加2mg双氰胺（终浓度）。
各人配制时，应注意所用的盐类和分子量，检查盐用量准确无误。
五、GUS染色液配方(1)制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。
B液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。
(2)取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O调至pH7.0。
(3)染色液：说明：1.除了TritonX-100, 甲醇, X-Gluc不用灭菌外其他的母液都要灭菌.其中K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]要用过滤灭菌的方法2.GUS活性的精确定位需要有亚铁离子。
GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2-，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。
材料准备：(1) 瞬时表达检测取浸染后的愈伤，稳定表达取分化前的愈伤。
(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。
直接染色法将准备好的材料浸泡在染液中，于37℃保温过夜。
六、潮霉素快速检测转基因幼苗的方法1、检测培养基成分：0.7% agar，1ml/L的6-BA，200mg/L的Hgy。
方法：先将只含有agar的去离子水煮沸，等冷却至55℃时加相应浓度的6-BA和Hgy，倒至培养皿中。
注：6-BA用于叶片的保鲜，检测培养基的配制无需灭菌处理，但培养皿需要烘干。
2、取样剪取并收集待检测苗1cm左右长的新鲜绿色叶片（两端均留有切口），平放于培养基上，30℃，16h光/8h暗培养48h,叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死。