医学博士科研计划书

LncRNA-ANCR基因表达对大鼠退行性脊柱侧凸影响的实验研究

退行性脊柱侧凸(degenerative scoliosis,DS)通常指机体骨骼成熟后出现的脊柱腰

段的侧凸,冠状面Cobb?角大于10°,同时可以存在矢状面失衡与/或脊椎的旋转异常。随着全球人口老龄化及老年人生活方式转变,DS已成为导致脊柱畸形、影响生活质量的一种腰椎退行性疾病。由于DS的具体病因还未明确解释,当前关于DS的研究绝大多数就是针对治疗,涉及病因学方面的基础研究很少。因此,进一步研究DS的病因及发病机制具有非常重要的意义。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)就是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明,LncRNA在调控表观遗传、细胞周期与细胞分化等细胞

分化与个体发育的生命活动中发挥重要作用,并与人类疾病的发生密切相关,其中包括癌症、退行性疾病在内的多种严重危害人类健康的重大疾病,成为当前研究热点。其中,ANCR(anti-differentiation ncRNA,抗分化ncRNA)为一个855 bp lncRNA,在细胞分化期间下调。ANCR在包含祖细胞群体中的减少,没有任何其她刺激,导致快速分化基因诱导。

本研究正就是选择LncRNA-ANCR这一基因,旨在通过研究该基因与大鼠DS之间作用关系,为进一步从分子生物学水平研究DS的发病机理,希望从发病的初始关键环节上预防该类型疾病发生。

参考文献

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创新点:

LncRNA就是当前的研究热点,在癌症方面研究相对较多,本研究借此热点探讨LncRNA-ANCR在大鼠DS发生发展过程中的作用。

若探明LncRNA-ANCR与DS之间的作用关系,从而人为地调控LncRNA-ANCR

的作用机制,从早期防治DS,为防治DS开辟一个新思路。

实验设计与技术路线:

1.重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体的构建、鉴定

(1)根据LncRNA-ANCR前体序列应用Primer premier 5 软件设计引物。

(2)利用PCR技术扩增出LncRNA-ANCR前体的DNA序列。

(3)LncRNA-ANCR前体的DNA序列重组入腺病毒miRNA表达载体。

(4)应用Lipofeetamine 2000将重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体与辅助包装质

粒共转染如293T细胞进行病毒包装。

(5)收集、浓缩、纯化与滴定重组LncRNA-ANCR腺病毒。

2、重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体转染大鼠BMSCs的细胞学研究

(1)大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养

选取2月龄大鼠,无菌条件下获取自体骨髓,用Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心法

进行分离、培养,获得自体原代骨髓干细胞,传代培养。应用CD45、CD34、CD29、CD105单克隆抗体,FACS(流式细胞仪)检测BMSCs表面抗原表达。

细胞分组:

基因组:LncRNA-ANCR载体转染的BMSCs

无关序列组:无关序列载体转染的BMSCs

空载体组:空载体的BMSCs

空白对照组:无特殊处理的BMSCs

(3)检测BMSCs分化指标

TaqMan RT-PCR与Western-blot方法分别检测各组BMSCs内BMP7 mRNA、Runx2 mRNA与GDF5 mRNA 以及相应蛋白表达

3、重组LncRNA-ANCR腺病毒表达载体对大鼠DS的动物实验研究

(1)实验动物:刚断乳的SD大鼠50只,分5组,每组10只。

(2)实验分组: