复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶的制备及其缓释性能研究

第３４卷第４期　２０１５年８月　

中国海洋药物　

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＡＲＩＮＥ　ＤＲＵＧＳ　Ｖ０Ｌ　３４　Ｎｏ．４　

Ａｕｇｕｓｔ，２０１５　

复合ｒｈＢＭＰ一２壳聚糖水凝胶的制备　及其缓释性能研究△　

谢尚举　，全仁夫　，李长明　，王拓　，杜伟斌　（１．杭州市萧山中医院骨科，浙江杭州３１１２０１；　２．浙江中医药大学第三临床医学院，浙江杭州３１００５３）　

摘　要：目的通过构建新型负载重组人骨形态发生蛋白２（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２，ｒｈＢＭＰ－２）壳聚糖水凝胶缓释系统来获得持续稳定释放的ｒｈＢＭＰ一２细胞因子。方法采用离子交联法制备　空白水凝胶，用１．０、１．５、２．０　ｍｇ・ｍＬ　浓度壳聚糖（ＣｈｉｔｏｓａｎＣＳ）分别与０．５、０．７、１．０　ｒｎｇ・ｍＬ１浓度三聚　磷酸钠（ＳｏｄｉｕｍＴｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅＴＰＰ）溶液按所含ＣＳ：ＴＰＰ质量比５：１交联，用冷冻干燥仪冻干。扫描电　镜观察各组冻干壳聚糖微观表面形态，比较各组溶胀系数，采用最低溶胀度组壳聚糖复合ｒｈＢＭＰ－２，酶联免　疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）动态检测最低溶胀度组壳聚糖水凝胶负载ｒｈＢＭＰ－２的缓释特性。结果１．５　ｍｇ・ｍＬ　浓　度ＣＳ与０．５　ｍｇ・ｍＬ　浓度ＴＰＰ交联所得水凝胶表现出最低溶胀度，溶胀度为２３８．２８　士２８．０６　，该组溶　胀度与其他各组比较，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。其冻干壳聚糖扫描电镜下呈三维网状结构，内部均　匀分布壳聚糖微球，将其负载ｒｈＢＭＰ－２后释放率为第１天２８．３２　±３．Ｏ１　，第３天４８．９２　±６．２７　，第１２　天７４．４０％±６．２９　。结论新型壳聚糖水凝胶且具有很好的承载和缓释ｒｈＢＭＰ－２的能力，可作为ｒｈＢＭＰ－２　的缓释载体。　关键词：重组人骨形态发生蛋白２；壳聚糖；水凝胶；缓释　中图分类号：Ｒ６８７　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—３４６１（２０１５）０４—０３１—０６　

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｌｏａｄｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　

ＸＩＥ　Ｓｈａｎｇ－ｊ　ｕ　，ＱＵＡＮ　Ｒｅｎ－ｆｕ¨，ＬＩ　Ｃｈａｎｇ－ｍｉｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｔｕｏ　，ＤＵ　Ｗｅｉ—ｂｉｎ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｘｉａｏｓｈａｎ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，　Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１０００９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００５３，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｏｂｔａｉｎｉｎｇ　ａ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ—ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２（ｒｈＢＭＰ－２）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｂｌａｎｋ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ１．０，１．５，２．０　ｍｇ・ｍＬ叫ｃｈｉｔｏｓａｎ（ＣＳ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｃｒｏｓｓ—ｌｉｎｋｅｄ　ｗｉｔｈ　０．５，０．７，１．０　ｍｇ・ｍＬ一　ｓｏｄｉｕｍ　ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＰＰ），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｍａｓｓ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ＣＳ：ＴＰＰ　ｗａｓ　５：１．Ｔｈｅｎ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｈｅ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ，ａｆｔｅｒｗａｒｄ，ｏｂ—　ｓｅｒｖｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌｓｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ　ｂｙ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　（ＳＥＭ），ａｔ　ｌａｓｔ，ｕｓｅｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｄｅｇｒｅｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｈ　ＢＭＰ－　

△基金项目：浙江省科学技术厅公益技术研究社会发展项目（２０１２Ｃ３３１１４）资助　作者简介：谢尚举（１９８９一），硕士研究生。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｅｓｈａｎｇｉｕ１２３＠１２６．ｃｏｍ　＊通讯作者：全仁夫，博士生导师，教授，主要研究方向：脊柱生物内固定材料的研究、中医药治疗脊柱关节科疾病的研究。Ｅ－ｍａｉｌ　Ｑｕａｎｒｅｎｆｕ＠１２６．ｃｏｍ　收稿日期：２０１４—１２—１２　３２　中国海洋药物　２．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｒｈ　ＢＭＰ一２　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　Ｓ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｂｙ　ｅｎ—　ｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ＥＬＩＳＡ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｗｈｉｃｈ　ｃｒｏｓｓ—ｌｉｎｋｅｄ　ｂｙ　１．５　ｍｇ　ｍＬ＿。ＣＳ　ｗｉｔｈ　０．５ｍｇ・ｍＬ　ＴＰＰ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｄｅｇｒｅｅ．ｔｈｅ　ｓｗｅｌｌｉｎｇ　ｄｅｇｒｅｅ　ｗａｓ　２３８．２８　９／６±２８．０６　，ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜　０．０５）．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｉｅｄ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｗａｓ　ｖｉｓｉｂｌｅ　ｕｎｄｅｒ　ＳＥＭ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｒｅ　ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｉｎ　ｇｅｌ　ｉｎｔｅｒｎａｌ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｈＢＭＰ－２　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ａｓ　ｆｅｌｌｏｗｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｎｏｖｅｌｒｈ　ＢＭＰ－２－ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ａｎｄ　ｓｐｌｅｎｄｉｄ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｏｎ　ｒｈＢＭＰ－２，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ　ｎｅｗ　ｗａｙ　ｆｏｒ　ｒｈＢＭＰ一２　ｉｎ　ｂｏｎｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２；ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｈｙｄｒｏｇｅｌ；ｓｕｓｔａｉｎｅｄ—ｒｅｌｅａｓｅ　

重组人骨形态发生蛋白２（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕ—　ｍａｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２，ｒｈＢＭＰ－２）属　于转化生长因子（ＴＧＦ－１３）超家族成员，具有强大　的骨诱导活性，其临床应用潜力已经受到广泛的　认可［１≈］。但在过去十几年的临床应用中却渐渐　发现其存在的问题和不足Ｅ４－５￣：首先，纯化的骨形　态发生蛋白半衰期短，植入体内后与体液和酶类　接触很快被扩散并水解，而骨修复所需时间则较　长＿６］。其次，一次性过量使用ｒｈＢＭＰ一２又带来许　多副作用，如植人物周围早期的骨溶解，继发植人　物松动和术后疼痛ｌ７｛］，术后脊柱周围水肿，椎管　内异位骨化等［９］。故寻找能够承载并缓释ｒｈ—　ＢＭＰ－２的方法，使局部可长时问维持稳定有效的　ｒｈＢＭＰ＿２浓度具有重要的理论和实际应用　价值　。Ⅲ］。　壳聚糖是１种无毒、具有良好生物相容性及　生物可降解性的天然材料，是自然界唯一带正电　荷的碱性多糖，其本身就具有一定的止血、抗菌、　抗癌转移等作用＿１　。壳聚糖带正电荷和一ＮＨ。基　团的特性使其可与带负电荷的聚合物、大分子蛋　白相互作用并成为某些药物的载体。壳聚糖缓释　载体的常用制备方法有：相分离法、离子诱导法、　乳化交联法、复乳化交联法等。由于ｒｈＢＭＰ一２易　失活，为保证载药水凝胶中ｒｈＢＭＰ一２活性，就要　严格控制制备反应过程。而离子交联法相对简　单、制备无需高温、无需与有机溶剂或者强酸、强　碱接触口　，本实验采用三聚磷酸钠作为交联剂，先　制备出空白干燥壳聚糖再利用壳聚糖水凝胶的吸　水溶胀作用将ｒｈＢＭＰ－２载人的方法，明显缩短了　ｒｈＢＭＰ一２在外界环境中的暴露时间，最大限度地　保证了药物活性。另外壳聚糖水凝胶的交联度越　大，水凝胶的溶胀度就越小，这是由于两者交联度　越大越易形成致密的网状结构，使水分子难以进　入凝胶内部。溶胀度越小的水凝胶对药物的包裹　也越致密，缓释效果也就越好。故本实验采用不　同浓度ＣＳ与ＴＰＰ配比交联，通过检测各组壳聚　糖水凝胶的溶胀度来筛选具有最佳缓释效果的壳　聚糖水凝胶负载ｒｈＢＭＰ－２并检测其缓释速率。　

１材料和方法　１．１主要试剂和仪器　壳聚糖（脱乙酰度＞９Ｏ　）（Ｓｉｇｍａ，美国）、三　聚磷酸钠（Ｓｉｇｍａ，美国）、ｒｈＢＭＰ＿２（Ｓｉｇｍａ，美国）；　ＥＬＩＳＡ试剂盒（Ｒ＆Ｄ，美国）；牛血清白蛋白（ＢＩＯ－　ＳＨＡＲＰ，诺扬生物）；滤器（ＭＩＬＬＥＸＧＰ，诺扬生　物）；精密ｐＨ试纸（三爱思试剂有限公司，上海）；　ＣＪＪ一６Ａ恒温磁力搅拌器（金伟实验仪器，江苏）；冷　冻干燥仪（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，美国）；酶联免疫测试仪　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｖａｒｉｏｓｋａｎ　Ｆｌａｓｈ，美国）；扫描　电镜（Ｓ－３０００Ｎ　ＨＩＴＡＣＨＩ，日本）；真空离子溅射　仪（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｅ－１０１０，日本）；纯水仪（Ｍｉｌｌｉ—　ＰＯＲＥ，美国）。　１．２空白壳聚糖水凝胶的制备　将不同质量壳聚糖（Ｃｈｉｔｏｓａｎ　ＣＳ）溶解于　０．３　９／５醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，配置成１．０、　１．５、２．０　ｍｇ・ｍＬ　３种浓度壳聚糖溶液。将不同　质量三聚磷酸钠（Ｓｏｄｉｕｍ　ＴｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅＴＰＰ）　溶解于超纯水中，配置成０．５、０．７、１．０　ｍｇ・ｍＬ　３种浓度三聚磷酸钠溶液。将不同浓度壳聚糖与　三聚磷酸钠溶液按表１所示的配对方法设置分　组。参照文献　的制作方法并加以改进，取各组　壳聚糖溶液１００　ｍＬ，以ＣＳ：ＴＰＰ总质量比５：ｌ