扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版)

相关仪器的信息：

透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号）TEM，产地：日本

超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利

扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克

临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本

真空喷镀仪：Eiko IB5 ion coater，产地：日本

包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USA

TEM样品包埋块制作有关注意事项

一、取材：

1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；

2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；

3、组织块大小：一般要小于1mm3。

二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞

的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。

1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中

2、使用锇酸的注意事项

I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。

II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。

三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的

反应。

四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包

埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。

脱水过程中应注意：

I 逐级脱水而不能急剧脱水；

II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；

III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。

五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外

空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。

包埋剂配制及使用过程中的注意事项：

I 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；

II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、

丙酮等混入包埋剂；

III配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。

表1 戊二醛溶液的配制

表2 0.2M 磷酸缓冲液（PBS ）的配制

按下表比例混合A 、B 液后，配成0.2mol/L 的母液，其中pH7.0为常用配方 pH 值 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0

A 液 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7

B 液

92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30

在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。

表3 多聚甲醛-戊二醛固定液的配制

表4 2%锇酸溶液的配制

A 液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液

B 液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 Na 2HPO 4 28.4g 或Na 2HPO 4.H 2O 31.61g 或Na 2HPO 4.2H 2O 35.6g 或Na 2HPO 4.7H 2O 53.63g 或Na 2HPO 4.12H 2O 71.64g

加双蒸水至1000mL

NaH 2PO 4 24.0g 或NaH 2PO 4.H 2O 27.6g 或NaH 2PO 4.2H 2O 31.21g

加双蒸水至1000mL

表5 Spurr包埋剂配方

注：通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE的用量则调节聚合反应的速度。

透射电镜样品制备程序：

No.1 包埋切片样品的制作过程

样品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：✧倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；

✧用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；

✧倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；

✧用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇

溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。

✧用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；

✧用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；

✧纯包埋剂处理样品过夜；

将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在日本JEOL 公司的JEM-1230型透射电镜中观察。

1).Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO4in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer.

2).Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to absolute acetone for 20 minutes. 3). Infiltration: The specimen was placed in 1:1 mixture of absolute acetone