噬菌体展示技术
详细叙述噬菌体展示技术的原理与操作流程
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简述噬菌体展示的基本原理和方法
简述噬菌体展示的基本原理和方法噬菌体展示是一种利用噬菌体（即细菌病毒）作为展示载体来展示外源蛋白的方法。
噬菌体是一种寄生在细菌上并以细菌为宿主的病毒，它具有高效的感染能力和高度选择性的感染靶细菌的特性，因此被广泛应用于基因工程、蛋白质工程和生物技术研究领域。
噬菌体展示的基本原理是将目标蛋白的编码基因与噬菌体的外壳蛋白基因相连接，构建成重组噬菌体基因。
在噬菌体感染细菌的过程中，重组噬菌体基因会被细菌细胞内的转录和翻译系统识别并表达出来，从而使目标蛋白与噬菌体的外壳蛋白相连，展示在噬菌体的表面。
噬菌体展示的方法主要有两种：一种是基于基因III的展示系统，另一种是基于基因VIII的展示系统。
基因III是噬菌体表面的主要外壳蛋白，通过将目标蛋白编码基因与基因III基因相连接，并在细菌细胞内进行表达，可以使目标蛋白与噬菌体的外壳蛋白连接在一起。
基因VIII则是噬菌体的次要外壳蛋白，通过将目标蛋白编码基因与基因VIII基因相连接，并在细菌细胞内进行表达，可以使目标蛋白展示在噬菌体的表面。
噬菌体展示的方法在实验室中可以通过以下步骤来进行：首先，将目标蛋白的编码基因与噬菌体的外壳蛋白基因进行连接，构建成重组噬菌体基因；然后，将重组噬菌体基因导入到感染性大肠杆菌等宿主细菌中；接着，通过培养宿主细菌，使重组噬菌体基因在细菌细胞内进行转录和翻译，从而使目标蛋白与噬菌体的外壳蛋白连接在一起；最后，通过离心分离和纯化的方法，获得展示目标蛋白的重组噬菌体。
噬菌体展示的优势在于其高效、高通量和高度选择性的表达特点。
由于噬菌体具有高效的感染能力和短周期的复制时间，可以在短时间内大量表达目标蛋白，并且可以通过筛选和分离的方法选择性地表达和纯化感兴趣的蛋白。
此外，噬菌体展示还可以实现对目标蛋白的定向进化和筛选，使其具有更好的性能和活性。
噬菌体展示在科学研究和应用领域具有广泛的应用价值。
在药物研发领域，噬菌体展示可以用于筛选和鉴定潜在药物靶点，并可以通过定向进化的方法优化药物分子的亲和性和特异性。
噬菌体展示技术的原理及应用
噬菌体展示技术的原理及应用引言：噬菌体展示技术是一种基因工程手段，在生物医学领域得到广泛应用。
它通过利用噬菌体作为载体，将目标蛋白质展示在噬菌体表面，从而实现了某种特定蛋白的高效筛选和研究。
本文将从噬菌体展示技术的原理及应用两个方面进行详细介绍。
第一部分：噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术的核心在于将目标蛋白质与噬菌体连接并展示在噬菌体表面。
这一步骤通常通过融合目标蛋白和噬菌体外壳蛋白的方式实现。
噬菌体外壳蛋白通常包括毒素结合蛋白（pIII）和胶原结合蛋白（pVIII）两种类型。
首先，将目标蛋白的编码序列与噬菌体外壳蛋白的编码序列相连，形成融合蛋白序列。
然后，将融合蛋白序列插入噬菌体基因组中，使其能够在噬菌体感染细胞后被表达。
最后，经过一系列筛选步骤，选择能够正确展示目标蛋白的噬菌体克隆，得到可以继续研究的目标蛋白样品。
噬菌体展示技术的原理其实比较简单，但是其应用范围非常广泛。
接下来，我们将针对几个典型的应用场景进行分析。
第二部分：噬菌体展示技术在药物研发中的应用噬菌体展示技术在药物研发中具有很大的潜力。
通过这一技术，可以筛选出具有特定功能的抗体或蛋白，用于研发新药。
例如，通过对癌细胞表面的特定蛋白进行展示，可以筛选出能够靶向癌细胞的药物。
这种药物在治疗癌症方面具有很大的潜力。
此外，噬菌体展示技术还可以用于筛选其他类型的药物靶点。
例如，许多感染性疾病的病原体表面都存在特定的蛋白结构。
通过将这些蛋白展示在噬菌体表面，可以通过筛选获得能够靶向这些病原体的药物靶点，为抗感染药物的研发提供重要的依据。
第三部分：噬菌体展示技术在生物工程中的应用除了在药物研发领域，噬菌体展示技术还在生物工程领域发挥着重要的作用。
在生物工程中，噬菌体展示技术可以用于筛选和改造特定酶。
通过将目标酶展示在噬菌体表面，可以利用大规模筛选技术快速获得具有特定催化性能的酶。
此外，噬菌体展示技术还可以用于疫苗研发和抗体工程。
通过将疫苗候选抗原或抗体展示在噬菌体表面，可以大大提高其免疫原性和特异性。
噬菌体展示技术
原理
• 以噬菌体为载体，把待选基因片段定向插 入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽 或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而 通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的 噬菌体.（基因VIII和基因III）
• p Ⅷ前体由73 个氨基酸残基组成，其中信 号肽为23 个氨基酸残基，根据构成外壳的 功能可分为四个区，6-24 氨基酸残基区域 占据噬菌体表面的大部分，25-35 氨基酸残 基区域高度疏水性,C 端(35-50 氨基酸残基区 域)与DNA相结合，构成完整的内壁，N端 (1-5氨基酸残基区域)为可活动的、外露在 噬菌体表面的肽段。
噬菌体展示系统的种类
丝状噬菌体展示系统
λ噬菌体展示系统 T4噬菌体展示系统 T7噬菌体展示系统
M13噬菌体展示外源基因模式图
λ 噬 菌 体 展 示 系 统
T4噬菌体展示系统
1.T4噬菌体病毒颗粒是在宿 主细胞内组装，被组装的 融合蛋白无需通过质膜， 不需要通过分泌途径，因 而其表面展示多肽和蛋白 的范围广。同时噬菌体还 能在体外组装，这对构建 表面展示噬菌体十分方便。 2. T4噬菌体展示周期在基于 T4生命的非必需衣壳蛋白 SOC和HOC。
淘洗过程
目标蛋白或肽固相化
展示的多肽与目标蛋白结合
洗去未结合的噬菌体
获得特异结合的噬菌体 扩增后进行下一轮淘洗 测序
• 筛选出的噬菌体的结合特性可以进 一步验证并从DNA 序列推导出来， 分析各个克隆间编码短肽的一致序 列，以确证筛选的特异性. 最后， 利用化学合成含一致序列的氨基酸 短肽，研究他们的亲和特性并推测 可能配体的生物学活性和结合或游 离状态的结构特点.
• pⅢ前体由424 个氨基酸残基组成，形成3-5 个拷贝，位于噬菌体的尾部，他由四个功 能区组成，信号肽区(18 个氨基酸残基)引导 pⅢ至细菌胞间质，在pⅢ分泌后被细菌蛋 白酶水解，其后的穿膜区与噬菌体的侵入 有关，受体结合区负责结合F 菌毛，而C 端 的疏水区组装前黏附在细菌内膜上，组装 后这段氨基酸序列锚在噬菌体外壳上，穿 膜区（N）是最外露的区域。
噬菌体展示原理范文
噬菌体展示原理范文噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，它可以将其DNA注入细菌细胞，并在其中复制自己的基因组，并最终使细菌溶解释放新的噬菌体颗粒。
噬菌体展示技术通过利用噬菌体对细菌的感染能力，将外源蛋白质的编码序列插入噬菌体基因组中并表达出来，以展示并提取出外源蛋白质。
首先，构建噬菌体基因组库。
基因组库通常是指噬菌体感染宿主细菌的基因组文库。
该步骤将感兴趣的基因组或cDNA文库插入噬菌体基因组中，这样就可以将感兴趣的蛋白质编码序列与噬菌体基因组连接起来。
连接之后，将这些重组噬菌体复制一定次数，使之数量扩增。
其次，插入融合蛋白质。
此步骤将融合蛋白质的编码序列与噬菌体基因组连接起来。
融合蛋白质通常包括两个部分：噬菌体表面显示蛋白（例如噬菌体pIII、pVIII或pIX）和外源蛋白质。
融合蛋白质的外源蛋白质通常是我们感兴趣的蛋白质（例如抗原、抗体、酶等），可以通过PCR或克隆技术得到编码序列。
连接之后，将这些重组噬菌体复制一定次数，使之数量扩增。
最后，展示和鉴定筛选。
展示步骤是为了将外源蛋白质展示在噬菌体的表面，通常利用噬菌体pIII或pVIII进行展示。
这些重组噬菌体在细胞表面显示融合蛋白质，这就意味着外源蛋白质也被一起展示了出来。
通过对表面展示的融合蛋白质进行筛选，可以鉴定出具有我们需要的外源蛋白质的克隆。
常用的筛选方法包括ELISA、免疫染色和流式细胞术等。
总之，噬菌体展示技术通过将外源蛋白质的编码序列插入噬菌体基因组并表达出来，实现了对外源蛋白质的展示和筛选。
它为我们研究蛋白质提供了一种有效的方法，并在药物开发和生物工程等领域具有重要的应用价值。
噬菌体展示实验步骤及总结
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
噬菌体展示技术
.噬菌体展示技术噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。
噬菌体的主要结构蛋白pⅧ和次要结构蛋白pⅢ均可作为载体来展示外源多肽。
pⅢ基因融合时表达强度低（每个噬菌体上有不超过5拷贝），与pⅧ基因融合时，表达强度高（每个噬菌体外壳上可能有2700~3000拷贝）。
在pⅢ和pⅧ基因的信号肽与成熟蛋白质编码区之间都有单一的克隆位点便于外源基因插入，表达的融合蛋白被分泌到细胞间质并由宿主蛋白酶切除信号肽，融合蛋白被作为结构外壳蛋白呈现到病毒粒子的表面。
噬菌体展示文库的构建当一组随机多肽编码序列或某种生物的基因插入噬菌体基因中进行表面展示时，其总体称为噬菌体展示文库（phage display li．Brary）。
早期的噬菌体展示体系是将编码外源蛋白或多肽的基因片段插入pⅢ的N端编码序列。
Smith最早构建的噬菌体展示文库就是将EcoRⅠ核酸内切酶基因片段克隆到f1噬菌体的pⅢ基因中。
1 pⅢ展示系统pⅢ是噬菌体的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠杆菌所必须的。
每个病毒颗粒都有3个~5个拷贝pⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。
其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠杆菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个pⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。
pⅢ有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于pⅢ蛋白的信号肽（SgⅢ）和N1之间时，该系统保留了完整的pⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与pⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整pⅢ蛋白来提供。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
pCANTAB5e噬菌体质粒图谱
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
辅助噬菌体可以提供噬菌粒复制、合成ssDNA和病毒包装所 需的所有蛋白和酶。能够帮助噬菌体载体在大肠杆菌体内包装复制。 比如M13KO7辅助噬菌体。
➢
M13KO7辅助噬菌体是由M13噬菌体改造而来，在M13复制起点
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.6 单链丝状噬菌体展示系统
丝状噬菌体是一个能够感染革兰氏阴性细菌的病毒大家族， 他们都含有单链DNA基因组，都包装于由含有几千拷贝的主要 衣壳蛋白（PⅧ）和位于顶端的次要衣壳蛋白（PⅢ）所组成的 少许柔韧性的管状衣壳中。M13和Fd噬菌体均是丝状噬菌体。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.6.3主要衣壳蛋白PⅧ展示系统
PⅧ展示系统。PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白， 位于噬菌体外侧，每个病毒颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝。 PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为 较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使 其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型 PⅧ蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。
噬菌体展示 Phage display
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
1.什么是噬菌体展示技术？
噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PDT) 是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳 蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而 编码该融合子的 DNA则位于病毒粒子内。使大量多肽 与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接 联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等） 的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
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噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
淘选过程中常见问题及解决方案
谢谢
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要的所有蛋白和酶。
筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
噬菌体展示技术流程
噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
噬菌体质粒-phagemid
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基
因，没有其他噬菌体基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
• 有供筛选的抗生素标记基因。
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
pIII展示和pVIII，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
筛选到的分子亲和力相 对低 高拷贝数增加了抗原性 应用于肽库
噬菌体展示系统 Phage on display
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
什么是噬菌体表面展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基 因III中，并与pIII蛋白融合展示。
复合物。 优点：克服直接包被的出现的问题 缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互 作用
• 洗涤去未结合的或非特异性 结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱 下来，并扩增，用扩增产物 进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的 DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位 置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽 或蛋白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。
噬菌体展示系统的分类
根据噬菌体不同： •温和噬菌体---M
膜上；与噬菌体组装终止有关。 • G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程
中，增加各个功能域之间的灵活性
主要外壳蛋白 pVIII
• 每子个病毒含约2700个拷贝， 约10%能有效地融合外源多 肽。以pIII融合子方式表达的 是单价的，而以pVIII融合子 方式表达的则是多价的。
• 这种多价pVIII展示所增加的 亲和力有利于筛选到亲和力 非常低的配体，而单价pIII展 示则将筛选限制在具有较高 亲和力的配体上。
M13噬菌体的组成和结构
1. 丝状噬菌体：M13。 2. 单链DNA病毒,6407 bp。 3. 基因组编码11种蛋白质，其
中5种为结构蛋白质。 4. 与展示密切相关的有pIII、
pVIII两种结构蛋白质。 5. DNA在细菌内滚环复制，细
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
M13噬菌体的生命周期
噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合
Bind to Streptavidin coated magnetic bead
biotin -antigen
第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合
第三步：洗涤—洗去非特异和弱结合的噬菌体
第四步：洗脱—将特异性结合的噬菌体洗脱下来
第五步：扩增—将洗脱的噬菌体扩增 扩增产物进行下一轮筛选
后面的筛选逐步加大筛选压力
多克隆和单克隆噬菌体ELISA
ELISA阳性克隆测序，最终得 到特异性结合的克隆序列
感染 和扩增
E.coli
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
合成组装病毒所需的ssDNA。
5. 第一代噬菌体在感染10分钟 后出现在培养液中