脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型
脂肪干细胞的提取及鉴定
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后A C Ss的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除AS Cs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DM EM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsi n,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C D29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
脂肪间充质干细胞的免疫学特性及其在组织工程中的应用
多 向分化潜能 ， 且来源广泛 、 取材方便 、 损伤小 、 增殖 迅速 、 表型稳定 ， 尤其是具有低免疫原性 ， 其在
异 源性 组织 工程 中 的研 究 已得 到人们 的广 泛关 注 。
激分子为 Ｔ细胞活化提供第二信号 。
ＭＨ Ｃ是 编码 主要 组织 相 容性抗 原 的基 因组 ， 这 些基 因彼 此连锁 在 一起 ， 具 有 控制 异 体 移 植 排斥 反 应、 免 疫应 答 和某 些 补体 组 分生 成等 功 能 ， 因 而
分化 的 多能干 细胞 ， 它可 以从 多个 部 位 获得 ，如 ： 骨
及神经细胞等多种细胞分化。例如 ， 在Ａ Ｄ Ｓ Ｃ ｓ 的基 础培养基 中加入胰 岛素 、 转化生长 因子一 Ｂ （ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ．
ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ － Ｂ， Ｔ Ｇ Ｆ — ｐ） 、 干 扰 素 和抗 坏 血 酸 ， 可 以诱 导其 向软 骨细胞 分化 。
以大 鼠 Ａ Ｄ Ｓ Ｃ ｓ为例 介 绍 其 分 离 培 养 和 分 化 如
原性 的重要因素。江丽 等 对大鼠 Ａ Ｄ Ｓ Ｃ ｓ 进行表
２ ０ １ ２—０ ９— ０ ６接收
面标 志检 测 时 发 现 ＭＨ Ｃ — Ｉ类 分 子 和 ＭＨＣ ． Ⅱ类 分
作者单位 ： 安徽 医科大学 口腔医学院 ， 安徽医科大学附属 １ ５ 腔医院牙 周黏膜 科 ， 安徽 省 Ｅ ｌ 腔 疾 病 研 究 中心 实 验 室 ， 合 肥
ＭＨ Ｃ成 为移植 排斥 反应 的关键 基 因 。与 ＭＨＣ抗原 递呈 功 能 密 切 相 关 的 主 要 是 Ｍ ＨＣ ． Ｉ类 分 子 和
目前 ， 由于异体细胞移植可能产生移植物抗宿 主病 ， 使得干细胞移植 、 组织工程仅局限于个体化治
人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究
人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【摘要】目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法.方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红0染色鉴定.实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pcDNA3.1 (+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs 加入10％ FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表达量.结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA 表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义.结论:转染EGF的HaCat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持.【期刊名称】《中国美容医学》【年(卷),期】2014(023)022【总页数】5页(P1899-1903)【关键词】脂肪间充质干细胞;HaCat细胞;表皮细胞;组织工程【作者】赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【作者单位】解放军第211医院五官科黑龙江哈尔滨150080;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R751;R64皮肤缺损是外科领域的常见问题，尽早封闭创面，减少机体消耗和内环境紊乱是治疗皮肤缺损的关键。
黄芪对脂肪源性干细胞成骨作用的初步探讨
黄芪对脂肪源性干细胞成骨作用的初步探讨王君;魏义勇【摘要】目的探索黄芪对脂肪源性干细胞(ASCs)成骨能力的影响,为诱导ASCs 向成骨分化提供一个更好的体外环境.方法复苏人ASCs细胞,当细胞生长至融合时传代,取第3代人ASCs用成骨诱导液进行培养,取第4代用于实验.实验共分为三组:空白组（完全培养基干预ASCs）、诱导组（成骨诱导液干预ASCs）和黄芪组（黄芪注射液与成骨诱导液按体积1.5:8.5配制干预ASCs）.采用MTT检测细胞增殖情况；RT - PCR检测成骨相关指标碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)mRNA的表达.结果 MTT表明在早期(3d)诱导组和黄芪组均促进了细胞增殖,与空白组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；随着干预时间的延长,诱导组和黄芪组细胞增殖速度反低于空白组,空白组增殖情况明显优于诱导组和黄芪组（P＜0.05）.RT - PCR表明诱导组和黄芪组均可促进ALP(0.42±0.02)、（0.61±0.01）和Collagen Ⅰ (0.39±0.09)、(0.56±0.18)的表达,与空白组(0.23±0.06)、(0.11±0.03)相比差异有明显的统计学意义(P＜0.05)；黄芪组与诱导组相比差异也有明显的统计学意义(P＜0.05).结论黄芪具有明显的促进干细胞向成骨细胞分化的作用,为黄芪参与骨缺损修复提供了一定的实验资料.%Objective To explore the effect of Huangqi on the differentiation of adipose - derived stem cells ( ASCs) into osteoblasts which will provide a comfortable environment to induced the differentiation into osteo-blasts. Methods ASCs were recovered and passaged. The third passage of ASCs was used for this experiment. The whole experiment was divided into the following groups: the control group, the induction group and the huangqi group. MTT was used to test the proliferation of ASCs and RT - PCR was used to test themRNA expression of ALP and Collagen I. Results MTT showed that the proliferation of ASCs was significantly promoted by both the induction and the Huangqi groups, compared with the control group (P <0.05) in the first time point and it was the contrary in the late period ( P <0.05 ). RT - PCR showed that the expression of ALP (0.42 ±0.02, 0.61 ±0.01) and Collagen I (0.39 ±0.09, 0.56 ±0. 18) increased significantly in the induction and the Huangqi groups, compared to the control groups (0.23 ±0.06, 0. 11 ±0.03) (P <0.05). And the Huangqi group significantly increased the expression of ALP and Collagen I compared to the induction group (P>0.05). Conclusion Huangqi may increase the osteoblastic ability of ASCs, which will provide a basis of theory by using the Chinese Medicine to repair bone defect.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2011(033)008【总页数】4页(P726-728,731)【关键词】黄芪;脂肪源性干细胞;成骨【作者】王君;魏义勇【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院伤骨科研究所,上海210000;上海交通大学医学院附属瑞金医院伤骨科研究所,上海210000【正文语种】中文【中图分类】R961Zuk等学者从人脂肪组织中分离出多能干细胞，并在体外特定诱导条件下成功实现其向骨、软骨和脂肪等方向的分化，之后这些多能干细胞被命名为脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs) [1]。
脂肪源性基质细胞特性及其向神经细胞分化的研究进展
１７ ・ ３０
Ｐ Ｃ Ｐ Ｓ ｐｅ ｅ ０ ０， Ｖｏ ， １ Ｎｏ ９ Ｊ Ｃ ＶＤ ｅ ｔｍｂ ｒ １ ２ ｌ ８ ．
・
综 述 ・
脂 肪 源 性 基 质 细胞 特 性及 其 向神 经 细 胞 分 化 的研 究进 展
刘 辉 ，元 小冬
【 关键词 】 脂肪源性基质 细胞 ；分化 ； 经细胞 神 【 中图分类号 ＪＲ３９５ 【 ２．４ 文献标识码】Ａ 【 文章编号 】１０ — ９１ （００ ９ １ ０ ０ ０８ ５７ ２１ ）０ — ３ — ３ ７
或者浓度过高会导致 Ａ Ｓ Ｄ Ｃ的贴壁性差 ；如果消化时间过短或 者浓度过低会 导致 Ａ Ｓ Ｄ Ｃ和脂肪组织中的 Ｉ 型胶原成 分没有充 分分离出来。不同厂家 的胶原酶活力会有 明显不同。红细胞是 另一个影响细 胞贴壁 的重要 因素 ，Ｈ ｒ ｅ ｎ等 实 验表 明使 ａｍ ｌ ｅ 用红细胞裂解液 可以消除红细胞对 Ａ Ｓ Ｄ Ｃ细胞的影响 ，同时其
３ ＡＳ Ｄ Ｃ的免疫原性 脂肪组 织 经过 消化 、离 心 弃 上 清后 获 得 的基 质 血 管层
（Ｖ ）表 达 造 血 干 细胞 相 关 表 型 （ Ｄ ｌ、Ｃ １、Ｃ ４ 、 ＳＦ Ｃ １ａ Ｄ ４ Ｄ ５
研究机构成功地应 用于成人 Ａ Ｓ Ｄ Ｃ的分离、培养
。此时成
人Ａ Ｓ Ｄ Ｃ可混有内皮细胞 、平滑肌细胞、血管周细胞 、周皮细 胞 、成纤维细胞 等 ，但是这些细胞的量是相 当少的 ，而且在换 液和传代过程 中可 以起到纯化细胞的作用 ，传代到第 ３代 的成
干细胞移植治疗 中枢神经系统损伤和变性疾病 已成为研究 热点 ，广 泛应用于基础研究及 临床治疗 。其中研究较多的是骨
髓 基 质 细 胞 （ ｏｅ ａ —ｒｗ ｓ ｏ ｌ ｅ ｓ Ｍ Ｃ ，但 骨 髓 基 ｂ ｎｍ ｒ ｏ ｔ ｍａ ｃｌ ，Ｂ Ｓ ） ｒ ｌ 质 细 胞 的获 取 给 病 人 带 来 一定 的痛 苦 ，且 数量 有 限 ，不 利 于 大
脂肪组织干细胞的研究进展
脂肪组织干细胞的研究进展杨立业;黄天华【摘要】脂肪组织中存在多能的干细胞,在体外可以长期增殖,在一定的条件下能够分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞、心肌细胞和平滑肌细胞,是一种新的组织工程和细胞移植的干细胞来源.本文综述了脂肪组织干细胞的培养、向多种方向分化和动物实验的研究进展.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2007(019)002【总页数】3页(P162-164)【关键词】干细胞;脂肪;分化【作者】杨立业;黄天华【作者单位】汕头大学医学院生物学教研室,广东,汕头,515041;汕头大学医学院生物学教研室,广东,汕头,515041【正文语种】中文【中图分类】R338.1组织工程的一个研究重点是种子细胞的来源问题，自体的多能干细胞应用到临床能够治疗疾病，造血干细胞是最早应用到临床的干细胞。
组织工程的一种细胞来源是骨髓基质，骨髓腔中含有几种细胞成分，包括间充质干细胞（mesenchyml stem cells，MSCs），它能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞，是目前骨和软骨组织工程的主要细胞来源[1]。
然而它的自体获得也受到一些条件的限制，并且一次骨穿获得的细胞数量有限。
另外一种潜在的自体干细胞来源是脂肪组织，它的获取可在局麻下进行，对病人的损伤较小。
脂肪来源的干细胞目前可称为脂肪来源的基质细胞（adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs），能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、神经细胞和平滑肌细胞[2-6]。
人类、大鼠和小鼠的ADSCs细胞培养方法相同[1，4，6]。
首先，获取的脂肪组织用缓冲液反复冲洗，剪刀剪碎，0.075%的胶原酶37℃消化30～50 min，800 g离心10 min，沉淀成分为基质血管层（stromal vascular fraction，SVF），DMEM培养基重悬细胞，筛网过滤离心，弃上清。
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。
ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。
大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。
同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。
目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。
为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。
1 脂肪组织采集1.1 脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。
采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。
采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。
脂肪干细胞的体外培养PPT讲稿
脂肪干细胞成脂分化
ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞，长期培养仍可维持此种分化能力。 脂肪细胞分化过程大致如下：
（1）脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化，形成脂肪母细胞（一种尚未出现脂滴的 梭形细胞）；（2）脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖，形成前体脂肪细胞 （此时细胞刚开始出现脂滴）；（3）前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖 和一系列基因表达的变化，形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞（内含大量小脂 滴）；（4）多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积，小脂滴逐渐汇集成一个大 脂滴充满脂肪细胞的大部分，形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞，成为成熟的脂 肪细胞。
Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细
胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自间 叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在ASC中的 含量甚低，不可能定向培养分化为其他组织细胞，但进一步确认和识别真正的 ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检
测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用，但鉴定脂肪干细胞的最好 方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功。
脂肪干细胞的表面标记
a)粘附分子：ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和 α4(CD49 d)；细胞间粘附分子1(ICAM 1，CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞 粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表 达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3，CD50)、整合 素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E selectin，CD62)； b)分子受体：可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体； c)细胞外基质蛋白和糖蛋白：ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、 Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)； d)肌蛋白：能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记：不表达 造血细胞标志物CD14、CD31或CD45； f)补体调节蛋白：确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白； g)组织相容性抗原：表达类组织相容性蛋白HLA-ABC，而不表达类蛋白HLA-DR。
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中国组织工程研究与临床康复第14卷第36期 2010–09–03出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2010 Vol.14, No.36 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH6685 1Department ofPlastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China; 2Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, ChinaCai Zhen☆, Doctor, Attending physician, Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China caizhen1976@126. comCorrespondence to: Jiang Hai-yue, Professor, Doctoral supervisor, Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China jianghaiyue@sohu. comReceived:2010-05-28 Accepted:2010-06-24脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型☆蔡震1，潘博2，林琳2，蒋海越2，庄洪兴2Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cellsCai Zhen1, Pan Bo2, Lin Lin2, Jiang Hai-yue2, Zhuang Hong-xing2AbstractBACKGROUND: Adipose-derived stem cells (ADSCs) are capable of multi-directional differentiation and exist in human processed lipoaspirate. However, no in-depth studies have addressed biological characteristics of adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) in vitro, and there are some disputes on the results from phenotype studies.OBJECTIVE: To investigate biological characteristics and phenotypes of human ADSCs.METHODS: Human adipose tissue was collected from persons undergoing fat extraction. The ADSCs were digested with collagenase, cultured and subcultured in vitro. Cell morphology was observed and growth curves were drawn. The phenotypes of ADSCs were identified by immunohistochemistry and flow cytometry.RESULTS AND CONCLUSION: ADSCs grew well, presented fibroblast-like growth. No significant change in cell morphology was detected within passage 15. The results from immunohistochemistry showed that cells were positive for CD29, CD44, CD105, but negative for CD34, CD45. Flow cytometry results have shown that cells were positive for CD29, CD44, CD105, MHC-Ⅰ, but negative for CD3, CD14, CD19, CD31, CD33, CD34, CD45, CD106, CD117, CD184. Results have suggested that ADSCs can be abundantly harvested and have stable proliferation in poorly differentiated status in vitro. Stem cell-related antigens were highly expressed in ADSCs.Cai Z, Pan B, Lin L, Jiang HY, Zhuang HX. Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(36): 6685-6688.[ ]摘要背景：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪来源的干细胞，并表现出多向分化的潜能，但是关于其体外的生物学特性研究不够深入，其细胞表型的研究结果存在一定争议。
目的：观察脂肪来源的干细胞的生物学特性与细胞免疫表型。
方法：取吸脂手术中废弃的人脂肪组织，胶原酶消化法获得脂肪来源的干细胞，体外传代培养，并进行细胞形态学观察，细胞生长曲线测定，免疫组织化学及流式细胞仪检测其细胞表型。
结果与结论：脂肪来源的干细胞生长旺盛，呈成纤维细胞样生长，15代以内细胞形态未见明显变化；免疫组织化学染色显示，细胞表面标记CD29，CD44，CD105表达阳性，CD34，CD45表达阴性；流式细胞仪检测显示，CD29，CD44，CD105，MHC-Ⅰ为阳性，CD3，CD14，CD19，CD31，CD33，CD34，CD45，CD106，CD117，CD184为阴性。
结果说明脂肪来源的干细胞体外生长能力旺盛，高表达干细胞相关抗原，可长期传代且保持低分化状态。
关键词：表型；脂肪来源的干细胞；流式细胞仪；生物学特性；干细胞doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.36.008蔡震，潘博，林琳，蒋海越，庄洪兴.脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(36):6685-6688. [ ]0 引言间充质干细胞是一群存在于身体各个组织内较原始的细胞，具有自我更新及多向分化潜能[1]，基于这些能力，间充质干细胞在其临床应用上有很大的潜力。
自2001年Zuk证实了经吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群后[2]，脂肪来源的干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)的概念得以明确，ADSCs因为其取材容易也被广泛研究。
有研究表明ADSCs在体外培养中能迅速增长，累积细胞倍增数在第13代时仍无明显的下降趋势；更为重要的是细胞传至第10代时，仅有5%的细胞进入了细胞衰老期。
因此ADSCs可以作为组织工程的种子细胞，成为具有广阔治疗应用前景。
关于ADSCs的细胞表型研究，目前的研究结果没有得到统一的认定。
本课题通过对ADSCs进行体外培养及对其体外生长的生物学性状及其细胞免疫表型做初步研究，为以后深入进行细胞组织工程的应用研究奠定了实验室基础。
1 材料和方法设计：细胞体外培养与鉴定。
时间及地点：于2008-01/2008-06在中国医学科学院整形外科医院中心实验室完成。
材料：实验标本：来自中国医学科学院整形外科医6686院吸脂手术中废弃的脂肪组织，与供者及家属签订知情同意书，供者均为20~45岁的患者。
主要实验试剂：试剂来源DMEM 高糖培养基、IMDM 培养基、M199培养基、 胎牛血清美国Hyclone 公司 间充质干细胞培养基 美国Invitrogen 公司胶原酶、胰蛋白酶 美国Sigma 公司 流式细胞检测的相关抗体 美国BD Bioscience 公司FITC 标记的荧光二抗与PE 标记的荧光二抗美国Santa Cruz 公司SP9000免疫组织化学试剂盒北京中杉金桥公司实验方法：ADSCs 的培养：收集吸脂术中废弃的脂肪组织，用含青链霉素的PBS 缓冲盐溶液冲洗3遍，测量脂肪的体积，加入0.5%Ⅰ型胶原酶，使其终浓度为0.075%，37 ℃消化30 min ，每5 min 振荡1次。
加入同体积的含体积分数10%FBS 的高糖DMEM 培养基终止消化，充分混匀后，1 500 r/min 离心5 min ，弃去上清液，加入含体积分数2%FBS 的间充质干细胞培养基5 mL ，重悬沉淀；200目滤网过滤，吹打均匀后用锥虫蓝排斥试验计数，细胞浓度为5×107 L -1，移入25 cm 2培养瓶内中，在37 ℃、体积分数5%CO 2饱和湿度的培养箱内培养。
倒置显微镜每日观察细胞生长状况，细胞贴壁后每两三天更换一次培养液。
待细胞融合达85%后传代。
ADSCs 生物学特性：取第3代生长良好的ADSCs ，用细胞表面标记物单克隆抗体进行免疫组化染色，流式细胞技术检测细胞表型，细胞生长曲线及倍增时间测定。