人胚胎干细胞研究进展
人胚胎干细胞的研究发展
人胚胎干细胞的研究发展人类胚胎干细胞研究是一个引人注目的领域，其重要性和潜力引发了广泛的讨论和争议。
胚胎干细胞具有无限的自我复制潜力和多向分化能力，可以分化为各种类型的细胞，包括神经细胞、心脏细胞、肌肉细胞等。
这使得胚胎干细胞具备了重建组织、器官和疾病治疗的潜力。
胚胎干细胞的研究始于上世纪六十年代，当时科学家发现，外部对胚胎细胞的营养环境可以影响其分化方向。
然而，由于道德和法律等限制，研究迅速受到限制。
直到1998年，英国生物学家汤姆逊（James Thomson）博士成功地从人类胚胎中分离出第一批人类胚胎干细胞，引发了人们对胚胎干细胞研究的兴趣和希望。
自那时以来，人们对胚胎干细胞的研究取得了长足的进展。
首先，研究者发展了一系列的培养技术，使胚胎干细胞能够在实验室中持续生长和自我复制。
这为大规模研究和应用奠定了基础。
其次，研究者发现胚胎干细胞可以分化为多种类型的细胞。
通过控制不同的生长因子和信号分子，研究者可以引导胚胎干细胞向特定细胞类型分化，如神经细胞、心肌细胞、肌肉细胞等。
胚胎干细胞的研究还为临床医学带来了巨大的希望。
首先，胚胎干细胞可以用于组织和器官的再生和修复。
例如，对于一些慢性疾病或器官损伤，研究者可以将分化出的胚胎干细胞植入患者体内，帮助恢复受损组织的功能。
其次，胚胎干细胞也可以用于疾病的模拟和药物筛选。
研究者可以将患者特定疾病相关的细胞从胚胎干细胞中分化出来，用于疾病的研究和药物的测试，在加速新药研发进程方面具有重要意义。
然而，胚胎干细胞研究依然面临许多挑战和争议。
首先，获得胚胎干细胞需要破坏胚胎，这引发了伦理和道德问题。
并且，目前只有少数国家允许在人类胚胎上进行研究，这也限制了胚胎干细胞的获取和应用。
其次，胚胎干细胞的分化过程仍然存在许多未知和不确定性。
研究者需要进一步了解这些过程，以确保分化出的细胞在临床应用中的安全性和有效性。
总的来说，人类胚胎干细胞的研究持续发展，具有巨大的潜力和前景。
人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的研究
人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的研究人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）是当今生物医学研究的重要热点之一。
这两种干细胞都具有自我更新和分化为多种不同类型细胞的能力，因此在组织再生、疾病治疗、药物筛选等领域有着广泛的应用前景。
本文将综述人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的研究现状和前景。
一、人类胚胎干细胞1. 发现和特点人类胚胎干细胞是在1998年，由美国犹他大学埃文斯实验室发现的。
它们是从人类胚胎的内细胞团（inner cell mass，ICM）中分离出来的非常原始的细胞，具有自我更新和无限增殖的能力，并可以分化为身体的所有不同类型的细胞，包括神经元、心肌细胞、肝细胞等。
这些特点使得人类胚胎干细胞成为组织工程和再生医学领域的重要研究材料，有着广泛的用途。
2. 研究进展和问题尽管人类胚胎干细胞潜力巨大，但是在研究和应用过程中依旧受到很多限制和问题。
首先，人类胚胎干细胞的获取受到伦理和法律的限制。
在许多国家和地区，胚胎干细胞研究和应用仍然是禁止或受严格限制的。
即使是在开放的国家，也需遵循伦理标准和规定的程序，获得胚胎干细胞。
其次，人类胚胎干细胞的使用也存在一些问题。
首先，人类胚胎干细胞具有致癌性和免疫排异等风险，不当的使用会导致一些不良后果。
其次，人类胚胎干细胞分化过程中的影响因素、机制以及调控方法还不完全清楚，因此在分化过程中的控制更为困难。
此外，用于分化人类胚胎干细胞的培养基和因子组合等方法，也在不断的优化和改进中。
二、诱导多能干细胞1. 发现和特点在人类胚胎干细胞受到法律和伦理限制的背景下，2006年，日本的山中伸弥等一众科学家发现了诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），这是人类成体细胞被诱导再生为早期胚胎干细胞状态的一种细胞，可以用于组织工程、疾病治疗、药物筛选等领域。
胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
04
胚胎干细胞体外诱导分化的应用前景
疾病治疗与药物筛选
疾病治疗
胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为特定类型的细胞，如神经细胞、心肌细 胞等，为疾病治疗提供了新的途径。例如，通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞 ，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
药物筛选
胚胎干细胞可在体外培养扩增，为药物筛选提供了大量的实验样本。通过比较胚 胎干细胞在药物处理前后的分化过程和表型变化，可以评估药物的疗效和副作用 ，为新药研发提供有力支持。
表观遗传修饰
表观遗传修饰可以影响胚 胎干细胞的分化，如DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等 。
03
胚胎干细胞体外诱导分化方法
化学诱导分化方法
化学诱导分化是利用化学物质 调节胚胎干细胞的分化过程。
常用的化学物质包括细胞因子 、激素、小分子化合物等。
这些化学物质通过调节胚胎干 细胞的基因表达、信号转导等 途径，诱导细胞定向分化。
组织工程与器官移植
组织工程
胚胎干细胞具有发育成各种组织的潜力，为组织工程提供了理想的基础材料。例如，可以诱导胚胎干细胞分化 为软骨、肌肉、血管等组织，用于修复或替换受损的组织器官。
器官移植
胚胎干细胞可分化为多种器官细胞，为器官移植提供了新的来源。与传统的器官移植相比，胚胎干细胞诱导分 化的器官具有更好的组织匹配性和更少的不良反应，有望成为解决器官短缺和提高移植效果的重要途径。
研究方法
采用体外培养胚胎干细胞的方法，通过添加不同的诱导因子 或采用特殊的培养条件，观察细胞的分化过程和分化产物的 特性，同时结合分子生物学、细胞生物学等技术手段分析相 关机制。
02
胚胎干细胞特性与分化机制
胚胎干细胞特性
生物学中的干细胞研究进展
生物学中的干细胞研究进展在生物学领域，干细胞是一类具有自我复制和分化潜能的细胞，它们在生物发育过程中起着重要的作用。
干细胞可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。
胚胎干细胞来源于早期胚胎，具有多能性，即可以分化为所有体细胞类型。
成体干细胞则存在于成人的各种组织和器官中，具有有限的分化潜能。
干细胞研究的重要性在于其潜在的临床应用，可以用于组织修复、再生医学和药物研发等领域。
近年来，干细胞研究在生物学领域取得了重要的进展。
首先，胚胎干细胞研究取得了重要突破。
胚胎干细胞具有多能性，可以分化为所有体细胞类型。
研究人员成功地将人类胚胎干细胞培养和扩增，并使其分化为心脏细胞、神经元和肌肉细胞等不同类型的细胞。
这些研究为组织工程、器官移植和疾病治疗提供了新的可能性。
其次，成体干细胞研究也取得了重要进展。
成体干细胞存在于成人的各种组织和器官中，具有有限的分化潜能。
近年来，研究人员发现，成体干细胞可以通过基因调控和细胞外环境的改变，被重新编程为多能性干细胞，称为诱导多能性干细胞（iPS细胞）。
iPS细胞可以分化为多种细胞类型，具有与胚胎干细胞相似的潜能和特点。
这项重大发现被认为是2012年诺贝尔生理学或医学奖的重要科技突破之一，为干细胞研究提供了新的方向。
此外，干细胞研究还在药物研发领域发挥着重要的作用。
传统的药物研发往往在动物模型上进行，但动物模型并不能完全模拟人类体内的生理和病理过程。
利用干细胞技术，研究人员可以将患者的细胞转化为疾病特定的细胞类型，用于疾病模型的建立和药物筛选。
这种个性化药物研发的方法可以提高疗效，并减少不必要的副作用。
干细胞研究还面临许多挑战和争议。
首先，胚胎干细胞的获取和利用涉及伦理道德问题，引发了公众的争议。
虽然越来越多的国家和地区开始为胚胎干细胞研究制定法律和政策，但在合规的前提下，研究人员仍需谨慎处理这些问题。
其次，研究人员面临着控制干细胞分化和成熟的挑战。
干细胞分化的调控机制非常复杂，需要更深入的研究来解决。
人类胚胎干细胞的分离与分化研究
人类胚胎干细胞的分离与分化研究人类胚胎干细胞是一种极具潜力的细胞类型，因为它们可以分化成任何类型的体细胞，包括肌肉细胞、神经细胞和心脏细胞等，这使得它们成为医学研究和治疗的重要目标。
人类胚胎干细胞的分离可以追溯到20世纪80年代末和90年代初。
当时，爱德华·艾文思博士和詹姆斯·汤普森博士在威斯康星大学医学院从人类胚胎中分离出了干细胞。
这项研究引发了广泛的关注和争议，因为这需要牺牲早期的胚胎。
一些人认为这是不道德和不可接受的，另一些人则认为这项研究具有重要的医学价值。
不久之后，科学家们发现了另一种方式来获得干细胞，即通过体细胞核移植（SCNT）。
这种技术涉及将一个成熟细胞的核移植到一个没有细胞核的卵细胞中。
然后，这个细胞开始发育成为一个胚胎，并从中提取干细胞。
这种技术的一个优点是，它可以利用个体的自体细胞来创造干细胞。
这意味着患者可以使用自己的细胞来治疗某些疾病，从而减少排异反应的风险。
近年来，人类胚胎干细胞的分离和分化研究已经取得了许多进展。
例如，科学家已经成功地将人类胚胎干细胞分化成心肌细胞，并使用它们来修复心肌损伤。
同样，科学家已经将人类胚胎干细胞分化成神经元，并使用它们来治疗帕金森病。
此外，研究人员还在探索人类胚胎干细胞分化成其他类型细胞的方法。
例如，他们正在尝试将干细胞分化成肝细胞，从而治疗肝病。
另外，科学家正在研究人类胚胎干细胞的分化，以治疗其他疾病，如糖尿病、癌症和脊髓损伤等。
尽管人类胚胎干细胞研究已经取得了许多进展，但它仍然存在许多技术和道德挑战。
例如，分离干细胞需要牺牲早期胚胎，这引发了许多道德争议。
此外，研究人员还需要探索如何使干细胞分化成正确的类型，以及如何避免出现排异反应等技术挑战。
总的来说，人类胚胎干细胞的分离和分化研究具有重要的医学价值，并且已经在某些情况下产生了非常有前途的结果。
尽管仍然存在许多技术和道德挑战，但随着技术的进步，人们可以期望看到更多的医学应用出现。
干细胞研究进展与应用研究报告
干细胞研究进展与应用研究报告干细胞是一种具有多能性的细胞，具备自我复制和分化为多种细胞类型的能力。
近年来，干细胞研究得到了快速发展，对医学领域的进展产生了积极的影响。
本文将对干细胞研究的最新进展以及其在医学应用中的潜力进行综述。
1. 干细胞的来源干细胞可以从多个来源获取，目前主要可以分为胚胎干细胞（ESCs）和成体干细胞（ASCs）两类。
1.1 胚胎干细胞（ESCs）胚胎干细胞是从早期胚胎中获得的多能性细胞。
它们具有广泛的分化潜能，可以分化为身体上任何部位的细胞类型。
然而，胚胎干细胞的获取涉及到胚胎捐赠和相关伦理道德问题，因此受到一定的限制。
1.2 成体干细胞（ASCs）成体干细胞主要存在于成体组织和器官中，包括骨髓、脂肪组织和皮肤等。
它们的多能性较低，主要分化为特定器官或组织的细胞类型。
成体干细胞的获取相对容易，可通过组织抽取或分离获得，不涉及伦理道德问题。
2. 干细胞研究的最新进展干细胞研究领域取得了一系列重要的突破和进展。
2.1 诱导多能性干细胞（iPSCs）诱导多能性干细胞是通过基因重编程技术将成体细胞重新转化为具有胚胎干细胞特征的干细胞。
这项技术由日本科学家山中伦也于2006年首次提出，具有重要的科研和医学应用潜力。
通过iPSCs的研究，人们可以更好地了解细胞命运和疾病发生的机制，并开发出个性化医疗的治疗方法。
2.2 细胞再生研究干细胞具有分化为多种细胞类型的能力，这为细胞再生研究提供了基础。
通过刺激干细胞分化为特定细胞类型，科学家可以尝试修复受损组织或器官。
例如，心肌细胞再生研究已经取得了一定的进展，为治疗心脏病提供了新的治疗方向。
2.3 疾病模型研究干细胞的研究不仅可以应用于细胞治疗，还可以用于建立疾病模型。
科学家可以利用干细胞技术将患者的细胞重新分化为特定细胞类型，并用于疾病模型的建立和药物研发。
这种方法可以更好地了解疾病的发生机制，为个性化治疗提供指导。
3. 干细胞在医学应用中的潜力干细胞在医学领域有着广泛的应用前景。
胚胎干细胞的制备及研究进展
胚胎干细胞的制备及研究进展摘要：胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。
ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面的研究应用中起着重要的作用。
引言近年来，随着科学技术的不断发展，世界各国对胚胎干细胞的研究不断深入，取得了许多突破性的进展[1]。
科学证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。
人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。
ES细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体[2]。
这意味着ES细胞将在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面发挥重要作用，为人类攻克癌症等疑难杂症开辟新的道路。
1胚胎干细胞胚胎干细胞是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞或附植后胚胎的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)通过体外分离培养而建立的克隆细胞系。
它具有与早期胚胎细胞相似的形态，即胞体小、核大、胞浆少且具有正常的二倍体核型。
ES细胞最突出的特点是只生长不分化，且保持早期胚胎发育的全能性，在饲养层上或含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的培养基中，可稳定传代，长期培养。
体外诱导分化可形成3个胚层的分化细胞。
另外，ES细胞还具有种系传递功能和具有培养细胞所有的特征[3]。
胚胎干细胞不但可用于研究哺乳动物胚胎早期发育和细胞谱系分化，还可对它的基因组进行操作，通过基因打靶、突变和转基因等技术，建立各种实验模型，研究发育、肿瘤、免疫以及人类遗传病等有关问题，大大推动和发展了哺乳动物生物学的研究。
胚胎干细胞的研究现状和前景
胚胎干细胞的研究现状和前景作为医学领域对人类健康带来重大影响的胚胎干细胞，在研究当中表现出的巨大潜力引起了全球学术界的广泛关注。
近年来，随着技术的不断发展和探索，胚胎干细胞的应用前景也逐渐明朗。
本文将从胚胎干细胞的研究现状着手，通过笔者的探索与总结，介绍胚胎干细胞未来应用的前景。
一、胚胎干细胞的研究现状胚胎干细胞，是指具有自我复制能力和多分化能力的干细胞。
这种干细胞可以作为定向分化成各种不同功能细胞的前体细胞，如神经元、心肌细胞、骨骼肌细胞等。
目前，胚胎干细胞每年的研究经费都在不断增加。
研究人员也在全球范围内增加了不少。
各个实验室也在不断努力地开发新方法，以提高胚胎干细胞的定向分化能力和效率。
自从1998年人类第一次成功从人类胚胎中分离出干细胞以来，胚胎干细胞的研究已经取得了不少进展。
随后几年中，研究人员不断深化对胚胎干细胞形成和分化机理的研究。
科学家们发现，胚胎干细胞可以通过人工操作进行定向分化，进而不断产生更多的特定细胞，从而开发新的疗法。
二、胚胎干细胞的应用前景在医学应用领域，胚胎干细胞的应用前景非常广泛。
这种干细胞可以用于治疗某些重大疾病。
比如，胚胎干细胞可以用于修复或替代某些细胞和组织，以实现器官再生。
目前，关于胚胎干细胞的临床治疗，国外已经展开了许多试验，其中不乏取得成功的案例。
应用举例：1. 心血管疾病研究胚胎干细胞可以分化成心肌细胞，然后在实验室模拟心肌梗塞等心脏疾病，进而寻找药物与其特异性靶点。
该方法已经被广泛应用，以加速寻找与活化心肌细胞有关的特异性靶点，以及开发新的药物治疗方法。
2. 红斑系统疾病研究针对红斑狼疮、白血病等红斑系统疾病等，科学家们研究了胚胎干细胞的起源和发育，以及它们分化为成熟血细胞的机制。
这些研究为红斑系统疾病的治疗开辟了新的道路。
3. 人造组织和器官研究胚胎干细胞可以分化成各种类型的组织，如肝细胞、神经细胞、胰岛细胞、骨骼肌细胞等。
这为临床使用提供了巨大的可能性，比如肝移植中使用的肝细胞、自体细胞移植涉及的骨骼肌细胞、使用胰岛细胞制造胰岛素等。
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人胚胎干细胞的研究进展周进学号10170807【摘要】干细胞( Stem Cell)是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。
胚胎干细胞( Embryonic stem cells, ES细胞)是一种早期胚胎内细胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。
人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化。
现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述。
【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述1、胚胎干细胞的概念胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。
胚胎干细胞属全能干细胞。
ESCs 这一名词因其来源于胚胎而得名, 但从研究角度来说, 其概念一直没有一个特殊的标准, 2001 年美国国立卫生院根据Austin Smith 对小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 对其概念提出了一系列标准[1]: ①、来源于内细胞团或囊胚上胚层; ②、能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态( 长期自我更新) ; ③、显示并维持正常、完整( 二倍体) 和稳定的染色体核型; ④、全能的ESCs 能够分化成三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 来源的所有细胞类型;⑤、在发育过程中能整合到所有胚胎组织中( 体外经长期培养的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合体动物后, 仍能产生所有组织) ; ⑥、具有能克隆形成胚胎细胞系的能力, 并能产生卵子或精子细胞; ⑦、基因克隆, 即一个单一的ESCs 能产生一群具有相同遗传特性的细胞( 克隆) , 这些细胞有着与亲代细胞相同的特征; ⑧、表达转录因子Oct- 4, 后者继而激活或抑制大量的靶基因, 以使ESCs 维持未分化状态; ⑨、可被诱导而继续增殖或进入分化状态; ⑩、缺乏细胞周期中的G1 期的限制点。
ESCs 大部分时间都处于细胞周期的S 期, 在此期进行DNA 合成。
与已分化的体细胞不同, ESCs 不需任何外界刺激来启动DNA 的复制。
其中①、②、⑤、⑥、⑦不适用于人的EGCs, ⑤和⑥不适用于人的ESCs, 所有的标准都适用于小鼠的ESCs。
2、胚胎干细胞的获取途径及其“多能性目前胚胎干细胞的获取途径主要有2个:一是从自然胚胎中获取,可在胚胎发育的不同阶段获得;二是通过细胞克隆得到的胚胎中获取,也可在胚胎的不同发育阶段获得。
随着克隆技术的发展,后者显得更为容易。
胚胎干细胞的多能性表现在它具有多种分化发育的潜能。
其多能性学术上用两个词来加以区分:全能(totipotent),即指受精卵及囊胚细胞所具有的能力,除具有分化为机体所有细胞类型的潜能外,还有形成完整生物体的潜能;多能(pluripotent),即指从内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(又称胚胎生殖系干细胞)衍生而来的细胞或细胞株所具有的能力，能形成包括生殖系在内的所有组织类型,但形成一个完整的生物体的可能性很小。
3、胚胎干细胞研究的主要物种类型3. 1人类目前全世界已取得了60 余种不同基因的胚胎干细胞系,主要分布在美国、澳大利亚、新加坡、印度及以色列等地。
由于助孕技术中的超促排卵及体外受精2胚胎移植(试管婴儿) 技术的不断成熟和在世界各地的迅速开展,人胚胎干细胞的来源显得比其他物种更为容易和丰富,同时因为研究的直接性而为广大学者所重视。
但由于法律和伦理的原因,胚胎干细胞的研究将受到诸多的限制。
3. 2 灵长类灵长类动物与人的关系密切且没有太多法律与伦理上的限制,所以灵长类胚胎干细胞是目前研究最多的胚胎干细胞种类,以恒河猴与绢猴为代表[2] 。
恒河猴与人类的关系最为密切,在生殖与生长发育过程中与人有许多相似之处,因此是胚胎学研究的最佳模型,恒河猴胚胎干细胞也就成了了解各种人体组织分化的很好的体外模型,但其生殖特性(性成熟晚、妊娠期长、单胎孕育等) 限制了其应用;绢猴为西半球灵长类动物,与人类的关系不如恒河猴近,但因其生殖特性在实验中获得了广泛的应用。
绢猴一般是多胎孕育,性成熟期只有18 个月,妊娠期较短,更重要的是绢猴的卵巢周期可以在前列腺素的调节下同步化,这就可能收集到大量生长发育一致的胚胎。
目前,绢猴胚胎干细胞为我们提供了一个了解灵长类胚胎移植和妊娠母系识别的非常重要的模型。
从恒河猴与绢猴胚胎中分离出的胚胎干细胞均具有其特有的一套特异性标志物,它们包括阶段特异性胚胎抗原3和4 (SSEA-3 和SSEA-4) 、高分子糖蛋白TRA-1-60 和TRA-1-81、碱性磷酸酶等。
这些标志物与标志人胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cells , EC 细胞) 的表面抗原相同。
这表明灵长类与人类在胚胎学上有高度的相似性,而鼠胚胎干细胞仅表达SSEA-1 与碱性磷酸酶活性,说明胚胎干细胞表面标志物具有物种差异。
3. 3 小鼠(mouse) 由于历史上的广泛应用及已明了的遗传学机制和多产特性,使小鼠成为哺乳动物胚胎学的主要研究对象。
世界上最早的胚胎干细胞株就是首先从小鼠胚胎中分离出来的。
胚胎干细胞分离及培养的方法学也是由此建立并发展起来的。
对小鼠胚胎干细胞做进一步研究有助于灵长类及人类胚胎干细胞研究的发展。
3. 4 其他如鱼、鸟、兔、猪等脊椎动物中亦能分离出多能胚胎干细胞株。
胚胎干细胞研究物种的多样化对于研究生物体的早期发生过程是十分必要和重要的,如细胞的谱系定型和重组基因印迹等,对基因修饰及核移植技术的研究和发展也有重要的作用。
4、胚胎干细胞的分离与增殖技术以从灵长类胚胎ICM中分离灵长类胚胎干细胞为例[3]简述如下。
4. 1 分离ICM前的准备准备小鼠原始成纤维细胞层。
将小鼠原始成纤维细胞用30Gy 的γ-射线处理,使它终止有丝分裂活动,以5 ×104 个/ cm2 的密度置于用0. 1 %动物胶处理后的组织皿中,加入培养液(80 % DMEM、20 %胎牛血清、0.1mmol/ L 22巯基乙醇和1 %非必需氨基酸溶液) ,置5 % CO2温箱中孵育过夜。
4. 2 分离ICM 将排卵后6d 的恒河猴囊胚(或排卵后8d 的绢猴囊胚) 放入0. 5 % DMEM 中孵育,至透明带破裂时立即将囊胚移入含兔抗恒河猴脾细胞(或兔抗绢猴脾细胞) 抗体的DMEM中,孵育30min ,经DMEM冲洗后再移入1 :10 的几内亚猪补体中30min ,再经DMEM 冲洗后,用吸管吸除ICM中的滋养层细胞,最后将ICM种植在饲养层上。
4. 3 胚胎干细胞的培养和增殖种植7～10d 后,将ICM来源的细胞团移入含0. 05 %胰蛋白酶的EDTA 中3～5min ,用吸管轻轻吹打使它散开,将细胞种植到新培养基上。
细胞集落形成后,再将单个细胞分离出来种植到新培养基上,如此反复,7～10d 进行1 次。
4. 4 胚胎干细胞的冷冻保存如需要将胚胎干细胞冷冻,最好在培养早期进行,选择细胞形态及核型均正常的细胞冷冻,并在液氮中长期保存。
4. 5 操作注意事项 (1) 定期将未分化的细胞集落从已分化的细胞中分离出来并种植到新的培养基上; (2) 转移细胞时尽量快,以免细胞发生解离和死亡; (3) 分离细胞集落时使每个部分含5～10 个细胞,否则细胞过多将导致分化,细胞过少则克隆的效率低; (4) 由于胚胎干细胞是对各种内毒素最为敏感的细胞,故要重视培养液和血清的质量; (5) 重视原始成纤维细胞的质量,没有原始成纤维细胞所有的胚胎干细胞将在7～10d 内分化或死亡,若原始成纤维细胞质量差,则不能有效地抑制胚胎干细胞的分化而导致培养增殖失败。
总之,胚胎干细胞的分离与培养是极其复杂的实验室技术,目前的培养条件尚不能避免胚胎干细胞的分化,而且随着培养周期次数的增多,胚胎干细胞的稳定性也会下降。
因此,如何改进培养条件和培养技术是胚胎干细胞研究中最重要的问题。
5、人类胚胎干细胞的来源主要有:(1)从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞[4];(2)从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能干细胞[5];(3)体细胞核转移(somaticcellnucleartransplantation,SCNT)。
6、人胚胎干细胞系的建立1989年Prea尝试从人畸胎瘤分离ES细胞,初步证明了人ES细胞系建立的可能性。
1998年Thomson领导的小组将合法获得的体外受精的人早期胚胎在体外培养至囊胚期,利用免疫外科手术去除透明带,以抗BeWO细胞的单抗作免疫标记,剔除外层细胞,以35Gyγ射线照射小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层,以DMEM+胎牛血清+谷氨酰胺+巯基乙醇+非必需氨基酸作为培养液,体外培养人囊胚内细胞群,9～15d后将长出的细胞团吹散或者用胰酶或EDTA消化,然后继续在小鼠滋养层细胞上生长,挑选具有均一的未分化形态的单克隆细胞团,吹散成50～100个细胞的小团后再行培养,如此重复直至成系。
在此期间每一步都需观察细胞染色体核型,以确定它未癌变。
此后细胞系经吹打或胶原酶IV处理长期传代。
他们从14个囊胚中,最终建立起5个人类ES细胞系:H1、H13、H14、H7和H19。
这些细胞系继续培养5～6个月传32代仍可继续生长[6]。
Gearhart领导的小组采用了与Thomson 小组不同的方法,从5～9周龄流产胎儿的性腺嵴(gonadalridges)及肠系膜中分离原始的干细胞(primordialgermcells,PGCs),命名为EG细胞。
以期避免因直接利用胚胎所造成的伦理学上的麻烦。
将EG细胞体外培养于小鼠成纤维细胞层上,培养体系中加入重组人LIF,重组人碱性成纤维细胞生长因子及Foskolin,7～21d后形成较大的多细胞集落,其形态与小鼠EG 或ES细胞集落相似。
经过一系列与Thomson实验室相似的免疫组化及功能实验,证明获得了可成系的人胚胎干细胞集落[7]。
迄今为止,除Thomson、Gearhart和Shamblott等的报道外,人ES细胞分离尚无成功报道,主要原因是人ES细胞建株的条件尚不成熟,而对人ES细胞体外诱导分化的研究至今尚无报道。
7、胚胎干细胞的应用前景及主要问题由于胚胎干细胞的高度复制能力及多向性分化的潜能,已展示出很好的研究、应用前景。
如将特殊改变的基因转导至ES细胞中,体外选择后将ES细胞导入机体,使ES中的遗传信息传达给子代,可能有助于克服出生缺陷,纠正某些遗传性疾病[8] ;将经过基因修饰过的ES或EG细胞与正常细胞放在一起形成嵌合体,研究发育进程中细胞与细胞之间相互作用对细胞突变的影响[9];将ES或EG细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入,研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响等[10~12] 。