《薄层色谱法》PPT课件
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薄层色谱讲义ppt课件
氧化铝、离子交换纤维素、硅藻土、乙酰 化纤维素及聚酰胺等。
2〕薄层板的制备
将1份吸附剂加3份左右的粘合剂 〔0.2%-0.5%羧甲基纤维素钠〕在研钵中向 一个方向充分研磨，使成均匀的糊状物， 然后再倒入已预备好的涂布器中，在玻璃 板上平稳地以直线方向挪动涂布器，使硅 胶浆均匀平整地涂布。室温枯燥后置烘箱 活化，普通在105-110℃加热30min，置枯 燥器中备用。薄层厚度普通为0.2-0.3mm
增修订工程
项目 类别
鉴别
检查
含量测定
特征
或指
纹图
显微
TLC
HP LC
GC
理化
通则
重金属 有害元
素
毒性 成分
其 他
谱
HPLC
TL CS
UV GC
其 他
10版 新增
259
1818
25
9
54 426
8
中成药
05版 收载
2811144ຫໍສະໝຸດ 1116102 627
8
提取物
10版 新增
05版 收载
21
3
2
5
1
11
16
2〕溶解样品的溶剂均有不同程度的洗 脱力，所以在上样的同时，样品在原位置 就呈环形展开，原点直径的分散促进了这 种展开，即所谓“上样环形色谱效应〞。 如样品在溶剂中溶解度很大，原点将变成 空心圈，这种效应对随后的线性展开呵斥 不利的影响，因此应选择样品在溶剂中溶 解度不宜太大的溶剂。
3〕供试液的溶剂在原点的残留，也会 改动展开的选择性，特别是供试液的溶剂 极性与展开剂的溶剂极性相差较大时更为 明显；因此，上样时同步枯燥或上样后枯 燥以除去原点残存的溶剂。如甲醇点后， 有残存甲醇时，就参与了流动相。所以应 该枯燥除去甲醇。
2〕薄层板的制备
将1份吸附剂加3份左右的粘合剂 〔0.2%-0.5%羧甲基纤维素钠〕在研钵中向 一个方向充分研磨，使成均匀的糊状物， 然后再倒入已预备好的涂布器中，在玻璃 板上平稳地以直线方向挪动涂布器，使硅 胶浆均匀平整地涂布。室温枯燥后置烘箱 活化，普通在105-110℃加热30min，置枯 燥器中备用。薄层厚度普通为0.2-0.3mm
增修订工程
项目 类别
鉴别
检查
含量测定
特征
或指
纹图
显微
TLC
HP LC
GC
理化
通则
重金属 有害元
素
毒性 成分
其 他
谱
HPLC
TL CS
UV GC
其 他
10版 新增
259
1818
25
9
54 426
8
中成药
05版 收载
2811144ຫໍສະໝຸດ 1116102 627
8
提取物
10版 新增
05版 收载
21
3
2
5
1
11
16
2〕溶解样品的溶剂均有不同程度的洗 脱力，所以在上样的同时，样品在原位置 就呈环形展开，原点直径的分散促进了这 种展开，即所谓“上样环形色谱效应〞。 如样品在溶剂中溶解度很大，原点将变成 空心圈，这种效应对随后的线性展开呵斥 不利的影响，因此应选择样品在溶剂中溶 解度不宜太大的溶剂。
3〕供试液的溶剂在原点的残留，也会 改动展开的选择性，特别是供试液的溶剂 极性与展开剂的溶剂极性相差较大时更为 明显；因此，上样时同步枯燥或上样后枯 燥以除去原点残存的溶剂。如甲醇点后， 有残存甲醇时，就参与了流动相。所以应 该枯燥除去甲醇。
经典色谱法分析技术—薄层色谱法(分析化学课件)
小
极性
大
薄层色谱固定相和流动相选择
2. 流动相展开剂的选择要求
薄层色谱分离中一般要求各斑点的Rf值在0.2～0.8之间，Rf值之 间应相差0.05以上.
3. 流动相展开剂的选择方法
如果单一展开剂分离效果不好，可用两种或两种以上的单一溶剂按 照一定比例混合而成的溶剂展开,可以达到较好的分离效果.
薄层色谱固定相和流动相选择 被测组分、吸附剂和展开剂的选择原则
常用溶剂的极性顺序为：
常用吸附剂的极性顺序为：
增
增
大
大
薄层色谱固定相和流动相选择
多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐
极 性
苷类（皂苷、黄酮苷、蒽醌苷）
渐 黄酮、蒽醌等苷元、有机酸
小
香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分
烷烃＜烯烃
＜二甲胺＜酯类＜酮
＜醚＜硝基化合物
类＜醛类＜硫醇＜胺 类
＜酰胺类＜醇 类＜酚类＜羧 酸类
分离原理
吸附薄层色谱分离原理
展开（分离）
分离过程：
制板→点样→展开→显色→定性定量分析
固定相--吸附剂
薄层色谱的固定相所用的吸附剂
流动相---展开剂
薄板的底端浸入到适当的流动相溶剂
吸附薄层色谱分离原理
薄 层 色 谱
点样
展开剂
吸附薄层色谱分离原理
分离原理：
展开剂在毛细管的 浸润作用下，带着 各组分沿着薄板向
薄层色谱固定相和流动相的选择
薄层色谱固定相和流动相选择
一、固定相（吸附剂）的选择
1. 选择原则 根据被分离组分的极性选择吸附剂：
被分离组分的极性强——弱极性吸附剂； 被分离组分的极性弱——强极性吸附剂；
薄层色谱固定相和流动相选择
《项目五TLC技术》PPT课件
– 采用多次点样法，第二次点加样应待前一次点样的溶剂 挥发后再进行。
– 同一快硅胶板上同时点多个样时，每个样需点在同一高 度
– 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul）。
精选ppt
10
• 展开
– 多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。
直立式层析缸示意图 1-层析缸； 精2选-薄pp层t 板 3-展开剂饱和蒸气；4-展开剂11
标注明其激发光波长。例 硅胶HF254
精选ppt
7
三 、TLC操作步骤
• 薄层板活化（可直接用商品TLC，不需活化）
– 涂布后的薄层先在室温下晒干，在使用前置适当
温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备
用。不同薄层活化条件略有不同，如：
• 硅胶
110℃
1h
• 氧化铝
110℃
30min
精选ppt
8
精选ppt
19
❖杂质检查方法 • 杂质对照品法（A） • 供试品自身对照法（高低浓度法）（B） • 对照物质法（C）
样对 A
样对 B
精选ppt
样对 C
20
精选ppt
21
任务1、检验某样品的纯度
样品1：溶解少量样品1进行薄层检测并计算Rf值
溶剂：乙醇
展开剂：石油醚：乙酸乙酯=4：6 （体积比）
任务2、混合物的分离
样品2：溶解少量样品2进行薄层检测并计算Rf值 溶剂：95%乙醇
展开剂：石油醚：乙酸乙酯=3：7（体积比）
任务3、 选择最佳Rf值（0.3－0.7）
样品3：溶解少量样品2进行薄层检测并计算Rf值 溶剂：95%乙醇展开剂：自己配置Fra bibliotek精选ppt
– 同一快硅胶板上同时点多个样时，每个样需点在同一高 度
– 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul）。
精选ppt
10
• 展开
– 多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。
直立式层析缸示意图 1-层析缸； 精2选-薄pp层t 板 3-展开剂饱和蒸气；4-展开剂11
标注明其激发光波长。例 硅胶HF254
精选ppt
7
三 、TLC操作步骤
• 薄层板活化（可直接用商品TLC，不需活化）
– 涂布后的薄层先在室温下晒干，在使用前置适当
温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备
用。不同薄层活化条件略有不同，如：
• 硅胶
110℃
1h
• 氧化铝
110℃
30min
精选ppt
8
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❖杂质检查方法 • 杂质对照品法（A） • 供试品自身对照法（高低浓度法）（B） • 对照物质法（C）
样对 A
样对 B
精选ppt
样对 C
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精选ppt
21
任务1、检验某样品的纯度
样品1：溶解少量样品1进行薄层检测并计算Rf值
溶剂：乙醇
展开剂：石油醚：乙酸乙酯=4：6 （体积比）
任务2、混合物的分离
样品2：溶解少量样品2进行薄层检测并计算Rf值 溶剂：95%乙醇
展开剂：石油醚：乙酸乙酯=3：7（体积比）
任务3、 选择最佳Rf值（0.3－0.7）
样品3：溶解少量样品2进行薄层检测并计算Rf值 溶剂：95%乙醇展开剂：自己配置Fra bibliotek精选ppt
第五章 薄层色谱法(共84张PPT)
荧光;银激活的ZnS和CdS, ZnS• CdS •Ag在366nm
的紫外线照射下能够产生荧光。 硅胶即可以进行吸附层析，又可以进行分配层
析，主要的区别是在于活化程度不同，前者活化程 度高，后者活化程度低。 （3）纤维素
可在实验室制备，取脱脂棉或滤纸剪成小
11/20/2022
12
块加适量的5％的盐酸，加热煮沸3小时，冷却
要于150－160度干燥1－3小时，备用。
（3）薄层板的活化
硅胶、氧化铝的活性与其含水量有关，
11/20/2022
25
含水量越低，吸附能力越强，其活度越高。 因此层析板在使用之前必须经过活化。对于硅胶 薄层其活化温度为105~110°C，氧化铝薄层的活
化温度为150~200°C，活化后的薄层板在使用 之前应放在干燥器中备用。
薄层层析中的吸附剂和柱层析相似，首先 应该考虑应如何层析，一般的讲，非极性或弱极 性的组分的分离用吸附层析，水溶性组分的分离 用分配层析。
常用的吸附剂：
（1） 氧化铝
氧化铝铺层时一般不加粘合剂，直接用干
11/20/2022
8
粉铺层，得到的层析板称为“干板” 或“软 板”，但也可以加煅石膏作粘合剂，这种混有 煅石膏的吸附剂称为氧化铝G，用氧化铝G加水，
3.各种特制薄层
由于工作需要，各种特制薄层相继出现，
这里介绍数种：
11/20/2022
29
（1）混合薄层 有两种吸附剂混合制成。例如，
为了降低硅胶的活度，可在其中加入一定量的硅藻
土铺层，也可以用硅胶：氧化铝（1：1）铺层，
对糖和醇具有较好的分离效果。 （2）酸碱薄层和pH缓冲薄层 在分离生物碱和氨基酸时，为了得到更好的
(2) 1958年斯塔尔对薄层层析的吸附剂和 涂铺工具进行了改革并使之标准化，克服了 技术上的困难，从此以后，薄层层析法得到 了迅速的发展。
的紫外线照射下能够产生荧光。 硅胶即可以进行吸附层析，又可以进行分配层
析，主要的区别是在于活化程度不同，前者活化程 度高，后者活化程度低。 （3）纤维素
可在实验室制备，取脱脂棉或滤纸剪成小
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块加适量的5％的盐酸，加热煮沸3小时，冷却
要于150－160度干燥1－3小时，备用。
（3）薄层板的活化
硅胶、氧化铝的活性与其含水量有关，
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含水量越低，吸附能力越强，其活度越高。 因此层析板在使用之前必须经过活化。对于硅胶 薄层其活化温度为105~110°C，氧化铝薄层的活
化温度为150~200°C，活化后的薄层板在使用 之前应放在干燥器中备用。
薄层层析中的吸附剂和柱层析相似，首先 应该考虑应如何层析，一般的讲，非极性或弱极 性的组分的分离用吸附层析，水溶性组分的分离 用分配层析。
常用的吸附剂：
（1） 氧化铝
氧化铝铺层时一般不加粘合剂，直接用干
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粉铺层，得到的层析板称为“干板” 或“软 板”，但也可以加煅石膏作粘合剂，这种混有 煅石膏的吸附剂称为氧化铝G，用氧化铝G加水，
3.各种特制薄层
由于工作需要，各种特制薄层相继出现，
这里介绍数种：
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（1）混合薄层 有两种吸附剂混合制成。例如，
为了降低硅胶的活度，可在其中加入一定量的硅藻
土铺层，也可以用硅胶：氧化铝（1：1）铺层，
对糖和醇具有较好的分离效果。 （2）酸碱薄层和pH缓冲薄层 在分离生物碱和氨基酸时，为了得到更好的
(2) 1958年斯塔尔对薄层层析的吸附剂和 涂铺工具进行了改革并使之标准化，克服了 技术上的困难，从此以后，薄层层析法得到 了迅速的发展。
薄层色谱法PPT参考课件
17
②点样 除另有规定外，在洁净干燥的环境下，用点样用的微
升毛细管（或其他符合要求的点样工具）点样与薄层板 上。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线与底边的 距离，视所用板的大小而定，如采用长度为10cm的板， 点样距离底边以10-15mm为宜，高效板一般8-10mm。 圆点状点样直径一般不大于4mm，高效板不大于2mm。 如样品容量较大，或为了改善分离度，也可点成的条带 状，条带状宽度一般为5-10mm，高效板条带宽度一般 为4-8mm。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不 干扰为宜。点样时须注意尽量不要损害薄层表面。一般 的自制硅胶G薄层板，板面的牢度不够，定量测定时需特 别注意小心点样，不要使原点部分的板面破损。
18
③展开 点样后的薄层板置入加有展开剂的薄层展开箱中，密闭，一般采用上行展
开，薄层板浸入展开剂深度一般要求溶剂最初的前沿距原点约5mm，展开至规 定展开距后立即将薄层权取出，晾干，以备检测。展开距离为8-15cm为宜，高 效板5-8cm为宜。
如规定需用展开剂或其他溶剂的蒸气预平衡者可在双槽展开箱的一侧加入 适量的溶剂，密闭，一般保持15-30分钟。溶剂蒸汽预平衡后，应迅速放入载有 供品的薄层板，立即密闭。如需达到饱和状态，可在展开箱内壁贴一被溶剂湿 润的滤纸使展开箱易于被蒸气平衡。如规定薄层板需要同时预平衡者，应将薄 层板放入箱内没有溶剂的一侧槽中，平衡后再将溶剂倾入此糟中展开（如图）。
365nm紫外光检视例图
254nm紫外光检视例图 15
⑥薄层色谱扫描仪
系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧 光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定 量的分析仪器。 薄层扫描仪不仅可以进行原位定量，薄层扫描全图谱对定性鉴别也能提 供有用的信息。
②点样 除另有规定外，在洁净干燥的环境下，用点样用的微
升毛细管（或其他符合要求的点样工具）点样与薄层板 上。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线与底边的 距离，视所用板的大小而定，如采用长度为10cm的板， 点样距离底边以10-15mm为宜，高效板一般8-10mm。 圆点状点样直径一般不大于4mm，高效板不大于2mm。 如样品容量较大，或为了改善分离度，也可点成的条带 状，条带状宽度一般为5-10mm，高效板条带宽度一般 为4-8mm。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不 干扰为宜。点样时须注意尽量不要损害薄层表面。一般 的自制硅胶G薄层板，板面的牢度不够，定量测定时需特 别注意小心点样，不要使原点部分的板面破损。
18
③展开 点样后的薄层板置入加有展开剂的薄层展开箱中，密闭，一般采用上行展
开，薄层板浸入展开剂深度一般要求溶剂最初的前沿距原点约5mm，展开至规 定展开距后立即将薄层权取出，晾干，以备检测。展开距离为8-15cm为宜，高 效板5-8cm为宜。
如规定需用展开剂或其他溶剂的蒸气预平衡者可在双槽展开箱的一侧加入 适量的溶剂，密闭，一般保持15-30分钟。溶剂蒸汽预平衡后，应迅速放入载有 供品的薄层板，立即密闭。如需达到饱和状态，可在展开箱内壁贴一被溶剂湿 润的滤纸使展开箱易于被蒸气平衡。如规定薄层板需要同时预平衡者，应将薄 层板放入箱内没有溶剂的一侧槽中，平衡后再将溶剂倾入此糟中展开（如图）。
365nm紫外光检视例图
254nm紫外光检视例图 15
⑥薄层色谱扫描仪
系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧 光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定 量的分析仪器。 薄层扫描仪不仅可以进行原位定量，薄层扫描全图谱对定性鉴别也能提 供有用的信息。
薄层色谱法基础课件.ppt
31
3 原位化学衍生化
在色谱分析的综合技术中，尤其对痕量组分的 检测，衍生化反应已成为重要手段之一。
在薄层色谱中，有些化合物本身无色，又无紫 外吸收与荧光，同时也找不到合适的显色剂，或者 有性质近似的化合物共存很难分离，这时可考虑在 原位进行适当的化学反应，使之产生紫外吸收、荧 光、显色，或使性质发生较大差异以利于分离。
2. 碘 元素碘的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定
位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态， 有利于薄层的进一步处理。 3. 水
水可作为一种非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，当许多憎水性 化合物展开后，用水喷薄层板，对光观察，在半透明的薄层板上，显 出白色不透明的斑点。
29
16
径向展开与普通展开的区别
17
4. 点样容器
➢ 定容毛细管 ➢ 微量注射器 ➢ 点样器
18
(五) 展 开
1. 水蒸气的影响
2. 溶剂蒸气的影响 3. 展开槽 4. 展开方式 5. 几种新型的展开技术 6. 展开操作
19
1.水蒸气的影响
在吸附薄层色谱的展开过程中，空气的相对湿度以及展 开槽中的水蒸气必须严格控制，微量的水也能对色谱分离结 果产生较大的影响。
(1)快速(数十秒~数十分钟) (2)分离效率高(多柱路) (3)灵敏度高
(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)
(4)显色方法多样(腐蚀性显色剂) (5)图象易保存
4
二. 基本参数
比移值（Rf） Rf =原点至组分点中心的距离/原点 至流动前沿的距离 组分A的Rf =a/c 组分B的Rf =b/c
(2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿 色背景上显现黄色斑，表示是脂肪族羧酸。
3 原位化学衍生化
在色谱分析的综合技术中，尤其对痕量组分的 检测，衍生化反应已成为重要手段之一。
在薄层色谱中，有些化合物本身无色，又无紫 外吸收与荧光，同时也找不到合适的显色剂，或者 有性质近似的化合物共存很难分离，这时可考虑在 原位进行适当的化学反应，使之产生紫外吸收、荧 光、显色，或使性质发生较大差异以利于分离。
2. 碘 元素碘的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定
位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态， 有利于薄层的进一步处理。 3. 水
水可作为一种非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，当许多憎水性 化合物展开后，用水喷薄层板，对光观察，在半透明的薄层板上，显 出白色不透明的斑点。
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径向展开与普通展开的区别
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4. 点样容器
➢ 定容毛细管 ➢ 微量注射器 ➢ 点样器
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(五) 展 开
1. 水蒸气的影响
2. 溶剂蒸气的影响 3. 展开槽 4. 展开方式 5. 几种新型的展开技术 6. 展开操作
19
1.水蒸气的影响
在吸附薄层色谱的展开过程中，空气的相对湿度以及展 开槽中的水蒸气必须严格控制，微量的水也能对色谱分离结 果产生较大的影响。
(1)快速(数十秒~数十分钟) (2)分离效率高(多柱路) (3)灵敏度高
(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)
(4)显色方法多样(腐蚀性显色剂) (5)图象易保存
4
二. 基本参数
比移值（Rf） Rf =原点至组分点中心的距离/原点 至流动前沿的距离 组分A的Rf =a/c 组分B的Rf =b/c
(2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿 色背景上显现黄色斑，表示是脂肪族羧酸。
薄层色谱法概述PPT课件【共52张PPT】
*
k 反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶剂强度 决定 I0 -（ IR + IT ）=差为被介质吸收并转换为热的光强 4 丙酮 0. 氧化铝—有碱性、中性、酸性 放置时间不宜太长，否则背景吸附剂也吸附碘，使信噪比降低。 硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。 薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。 归一化法、内标法、外标法 这种影响一般使分配系数变小。 此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。 这类扫描仪技术上一些问题还未解决。 51 / 二氧六环 0. 展开距离一般为10-15cm。 单光束双波长——对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。 HPLC一次只能分离一个样品，通常采用反相色谱，色谱后衍生化受限制。
*
*
点样 要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。 采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。 点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul），微量注射器。
*
*
自动点样 Limomat IV 喷样仪——样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。 特点：适合于大量稀样品溶液的喷加；条带宽度不超过2mm，有利于改善分辨率；便于狭缝式光密度计扫描；要求薄层板强度高。 自动薄层色谱点样仪——由计算机控制。 药典规定：点样基线距底边2.0cm, 样点直径2-4mm, 点间距离约为cm。
*
薄层色谱参数
保留参数（Rf值） 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。 Rf=Ls/L。，
中药材薄层层析ppt课件
3）对照品和对照药材同时对照(“双对照”) 为了准确检验制剂投料的真实性，有时仅用对照
品无法鉴别出来，这时可增加原药材作为对照药材。 例如含有黄连、黄柏的制剂，单用小檗碱对照品
来鉴别是不足足以说明的，此时应增加黄连作为对照 药材进行检视。
要求样品色谱图中的主要斑点应与对照品和对照 药材色谱图中的有关斑点相一致，从而大大提高了薄 层色谱鉴别法的专属性和整体性，可有效地检出药品 是否使用了假冒药材。
为了得到较清晰的色谱图，供试液的制备要求：被测成分 尽可能多的提取出来，杂质要尽可能多的除去。
2）薄层色谱的点样 点样是关键的一步，既关系到能否得到可重现的薄层色谱，
也关系到定量结果的准确与否，不良的点样是测定误差的主要 来源。
3）吸附剂的活性与相对湿度的影响 硅胶为亲水性吸附剂，其含水量越高，吸附活性越弱，自
中药材的薄层色谱法鉴别
薄层色谱法：在中药材及其制剂的定性鉴 别中得到广泛的应用，这主要是由于其具有分 离分析双重功能，大大提高了鉴别工作的灵敏 度和专属性，成为中药鉴别的重要方法。
薄层色谱法还可用于药品的杂质检查和含 量测定。
中国药典大多数品种采用硅胶薄层色谱法， 少数使用聚酰胺薄层色谱法和氧化铝薄层色谱
3、对照物的选择
对照物分为对照品（主要为有效成分和特征性成分的单体， 也包括对照提取物）和对照药材两种。
对照物的设置有以下三种方式： 1）对照品对照：
用已知中药制剂某一种有效成分或特征性成分对照品制成 对照液，与样品在同一条件下层析，比较相同位置有无同一颜 色（或荧光）的斑点，来检测是否含有某原料药材。可设置一 种或数种对照品。 2）对照药材对照：缺乏对照品的情况下使用
（254nm）下观察板面上该成分形成的荧光淬灭色谱。
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35
(七) 薄层层析的定量测定
• 展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量，其测定方法可分为两大类： • 一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点中的组分用适当溶剂洗脱，再选用适当
方法定量； • 另一类为直接测定法，色谱分离后，直接用肉眼观察比较或用仪器扫描斑点而
测定其含量。
36
1 洗脱测定法
1 斑点的定位 2 斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附吸下，然后用洗脱溶剂洗脱。 3 测定 (1)紫外分光光度法：洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。同
2.点样量
点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的 灵敏度有关。一般来说，样品量最小为几ng，常用量 为几至几十µg，制备型的分离可以点样到mg量。总之 点样量随分离目的而定。
3.点样方式 最好是直径3—5mm的圆点。
常用的点样方式
a 一般点样 b 径向点样 c 条状点样 d 线形小孔点样
e 样品填入沟槽
• 常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。 • 吸附剂的选择：首先决定于样品成分的性质，即它们的溶解性、酸碱性、极
性以及是否与吸附剂起化学反应等； • 其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其价格等。
8
9
(二) 薄层板的制作
层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（纸浆、纤维素、硅胶、中性氧化物、 聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化键合硅胶等）均匀地涂在在薄层板（玻璃板、 金属板或弹性塑料板）上，干燥（110℃活化）后即可使用。
4
薄层色谱与柱层析和纸层析比较
(1)快速(数十秒~数十分钟) (2)分离效率高(多柱路) (3)灵敏度高
(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)
(4)显色方法多样(腐蚀性显色剂) (5)图象易保存
5
二. 基本参数
比移值（Rf） Rf =原点至组分点中心的距离/原点 至流动前沿的距离 组分A的Rf =a/c 组分B的Rf =b/c
化学检出法是在薄层上使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成 有颜色的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。 显色剂 一般分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。
1 通用显色剂
(1) 浓硫酸或50%的硫酸溶液：极大多数有机物质，喷此种显色 剂后立刻或在加热到110—120℃并经数分钟后出现棕色到黑色斑 点。
（1）为被分离化合物的极性（2）为 吸附剂的活度（3）为展开剂的极性。 若将这三个因素各自固定在圆周的
三分之一，转动圆盘正中的三角形，
如果角A指向极性物质，则角B指向 活度小的吸附剂，角C就指向选用极 性展开剂；如转到A’，B’，C’处则又 要作另外的选择组合。
12
多元展开剂中各种溶剂的作用
➢ 极性较大的溶剂可以使化合物在薄层上移动。 ➢ 极性较小的溶剂降低极性大的溶剂的洗脱能力，使Rf值降低。 ➢ 中等极性的溶剂往往起着使极性相差较大溶剂混合均匀的作用。 ➢ 在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高
酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄层色 谱检出某些有机磷农药。
34
5 放射显影法（Autoradiography）
就是用含放射性同位素的化合物在薄层上显示位 置的方法。具体方法是使薄层上同位素的辐射线透过 照相底片，显影以后由于银粒而显出潜影，在一定剂 量范围内，放射性物质斑点使底片所呈暗度与斑点中 放射性物质的浓度成正比，因此不仅可定位，还可定 量。
化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量 其荧光强度而进行定量。 3.荧光淬灭法
展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间，符 合一定的线性关系。 3 仪器测定法
39
3 仪器测定法
用光密度计或称薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量，该方法 已成为薄层定量的主要方法。 1.吸收测定法
展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光 度的变化，得到扫描曲线。
利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出样 品含量。 2.荧光测定法
PMD） (6) 阶式展开（stepwise development） (7) 梯度展开（gradient development）
26
6 展开操作
1.展开槽的密闭 目的是使展开槽被展开剂蒸气饱和并使展开剂组成
不变。 2.展开槽的饱和
为避免“边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气饱和 有时是必要的。 3.展开距离
硅胶薄层板吸附水蒸气的速度很快，0.25mm厚、20×20cm 的薄层板在50%相对湿度中约3分钟就失去活性的一半，而15 分钟时吸附的水分已达到最大值，因此，点样速度的快慢， 空气相对湿度的大小，都可以影响分离以及重现性。
适宜的相对湿度范围也决定于溶质和溶剂的极性。
21
2. 溶剂蒸气的影响
“边缘效应”：Stahl在用氯仿甲醇（95：5）为展开剂展开麦 角生物碱时发现，对同一种生
有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。
对于无色物质，可根据化合物的性质，用物理检 出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射性检出法进行
显色。
29
1 物理检出法
1 .紫外光 一般来说，对于未知化合物，展开后在用显色剂以前，都应先
在紫外灯下进行察看。紫外光常用两种波254nm与365nm。 如果化合物能吸收紫外光同时放出荧光，可用此荧光定位。
10
(三)薄层层析中展开剂的选择
主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。 各种展开剂按其极性不同排序为：
烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<酯类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类 <酚类<羧酸
11
选择薄层条件的简图
图2 化合物的极性、吸附剂的活度及展开 剂极性间的关系
Stahl设计的用以选择薄 层条件的简图
13
在具体工作中，展开剂的选择还必须进一 步通过实践，一般可用下列三种方法： (1)查阅文献 (2)微型薄层 ：用小玻片铺上薄层，用各 种经初步选择认为可能应用的展开剂展开， 从而选择适当的展开剂，再用于一般的薄层 层析。用微型薄层，节省材料和时间。 (3)微量圆环技术
14
微量圆环技术
将试样溶液点于已准备好
33
4 生物与酶检出法(bioautography)
生物检出法又称生物自显影法是用生物检定法检出 薄层上具有生物效应的物质如抗生素的方法。基于检 出物质的生物活性，将薄层板与已培养有适当微生物 的琼脂表面接触，并置适宜温度的培育箱内，经过一 段时间后观察抑菌点，有抗生素斑点处的培养基微生 物生长受到抑制，整个琼脂板出现了抑菌点，由此抑 菌点可对该抗生素组分定位。
常用的薄层色谱法以吸附剂为固定相,属于吸附色谱的范畴
3
特点
薄层色谱与液相色谱法比较
HPLC
TLC
每次只能分析一个样品
在一块板上点上多个样品 同时进行分离
对样品制备要求高，必须不 用毕一次弃去，可直接用 含可吸留在柱上的杂质，否 样品的粗提物点样 则柱性能受损
可用检测器种类较少
展开后可用多种手段检测
物碱，在薄层板中部的Rf值比在 边缘的Rf值小，称此现象为“边 缘效应”（edge effect）。
展开槽中被展开剂蒸气饱和
后再进行展开就可以消除。
图5 在未饱和展开槽中薄层板上出现 的“边缘效应”
22
➢ 普通展开槽 ➢ 双底展开槽 ➢ 水平展开槽Leabharlann 3.展开槽4.展开方式
(1)近水平展开：将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.5cm，薄层上端垫高使薄层 与水平成5-10º的角。
2. 碘 元素碘的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定
位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态， 有利于薄层的进一步处理。 3. 水
水可作为一种非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，当许多憎水性 化合物展开后，用水喷薄层板，对光观察，在半透明的薄层板上，显 出白色不透明的斑点。
2.化学检出法
分离度。 ➢ 用粘度太大的溶剂时需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘度，加
快展开速度。 ➢ 例如环己烷-丙酮-二乙胺-水（10:5:2:5）这个系统中，
水是极性大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以降 低作分用离，物少质量的二乙Rf值胺，的丙加酮入起控着制混了匀展整开个剂系的统pH及值降以低使展分开离剂后粘的度斑的 点不致拖尾，分离清晰。
(2)上行展开：将点样后的薄层放在盛有展开剂的直立型的展开槽中，展开剂由 薄层下端借毛细管作用上升至前沿。
(3)下行展开 (4)双向展开
24
薄 层 板
上行法
层
析
缸
薄层板
展开剂
玻璃板 上涂吸附剂层
SiO2 Al2O3
下行法
层
析
缸
薄层板
滤纸条 展开剂
25
几种新型的展开技术
(1) 程序蒸气展开（Vapor-programmed，VP） (2) 圆形色谱（Radial Chromatography） (3) 热板色谱(Hot plates Chromatography) (4) 多次展开（Multiple Development ） (5) 程序多次展开（programmed Multiple Development，
(2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿色背景 上显现黄色斑，表示是脂肪族羧酸。
常用的通用显色剂还有：5%磷钼酸乙醇、 碱性高锰酸钾溶液、 硝酸银-氢氧化铵试剂、荧光显色剂等。
2 专属性显色剂
指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。
例如2%2，4-二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120℃加热10分钟，醛 酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑。
相对比移值，即相对于某一物质x的Rf值，用Rx表 示。
其定义为：Rx＝组分的Rf值／物质x的Rf值 组分A相对于物质B的“相对比移值” RB =a/b
(七) 薄层层析的定量测定
• 展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量，其测定方法可分为两大类： • 一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点中的组分用适当溶剂洗脱，再选用适当
方法定量； • 另一类为直接测定法，色谱分离后，直接用肉眼观察比较或用仪器扫描斑点而
测定其含量。
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1 洗脱测定法
1 斑点的定位 2 斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附吸下，然后用洗脱溶剂洗脱。 3 测定 (1)紫外分光光度法：洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。同
2.点样量
点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的 灵敏度有关。一般来说，样品量最小为几ng，常用量 为几至几十µg，制备型的分离可以点样到mg量。总之 点样量随分离目的而定。
3.点样方式 最好是直径3—5mm的圆点。
常用的点样方式
a 一般点样 b 径向点样 c 条状点样 d 线形小孔点样
e 样品填入沟槽
• 常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。 • 吸附剂的选择：首先决定于样品成分的性质，即它们的溶解性、酸碱性、极
性以及是否与吸附剂起化学反应等； • 其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其价格等。
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(二) 薄层板的制作
层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（纸浆、纤维素、硅胶、中性氧化物、 聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化键合硅胶等）均匀地涂在在薄层板（玻璃板、 金属板或弹性塑料板）上，干燥（110℃活化）后即可使用。
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薄层色谱与柱层析和纸层析比较
(1)快速(数十秒~数十分钟) (2)分离效率高(多柱路) (3)灵敏度高
(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)
(4)显色方法多样(腐蚀性显色剂) (5)图象易保存
5
二. 基本参数
比移值（Rf） Rf =原点至组分点中心的距离/原点 至流动前沿的距离 组分A的Rf =a/c 组分B的Rf =b/c
化学检出法是在薄层上使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成 有颜色的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。 显色剂 一般分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。
1 通用显色剂
(1) 浓硫酸或50%的硫酸溶液：极大多数有机物质，喷此种显色 剂后立刻或在加热到110—120℃并经数分钟后出现棕色到黑色斑 点。
（1）为被分离化合物的极性（2）为 吸附剂的活度（3）为展开剂的极性。 若将这三个因素各自固定在圆周的
三分之一，转动圆盘正中的三角形，
如果角A指向极性物质，则角B指向 活度小的吸附剂，角C就指向选用极 性展开剂；如转到A’，B’，C’处则又 要作另外的选择组合。
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多元展开剂中各种溶剂的作用
➢ 极性较大的溶剂可以使化合物在薄层上移动。 ➢ 极性较小的溶剂降低极性大的溶剂的洗脱能力，使Rf值降低。 ➢ 中等极性的溶剂往往起着使极性相差较大溶剂混合均匀的作用。 ➢ 在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高
酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄层色 谱检出某些有机磷农药。
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5 放射显影法（Autoradiography）
就是用含放射性同位素的化合物在薄层上显示位 置的方法。具体方法是使薄层上同位素的辐射线透过 照相底片，显影以后由于银粒而显出潜影，在一定剂 量范围内，放射性物质斑点使底片所呈暗度与斑点中 放射性物质的浓度成正比，因此不仅可定位，还可定 量。
化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量 其荧光强度而进行定量。 3.荧光淬灭法
展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间，符 合一定的线性关系。 3 仪器测定法
39
3 仪器测定法
用光密度计或称薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量，该方法 已成为薄层定量的主要方法。 1.吸收测定法
展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光 度的变化，得到扫描曲线。
利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出样 品含量。 2.荧光测定法
PMD） (6) 阶式展开（stepwise development） (7) 梯度展开（gradient development）
26
6 展开操作
1.展开槽的密闭 目的是使展开槽被展开剂蒸气饱和并使展开剂组成
不变。 2.展开槽的饱和
为避免“边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气饱和 有时是必要的。 3.展开距离
硅胶薄层板吸附水蒸气的速度很快，0.25mm厚、20×20cm 的薄层板在50%相对湿度中约3分钟就失去活性的一半，而15 分钟时吸附的水分已达到最大值，因此，点样速度的快慢， 空气相对湿度的大小，都可以影响分离以及重现性。
适宜的相对湿度范围也决定于溶质和溶剂的极性。
21
2. 溶剂蒸气的影响
“边缘效应”：Stahl在用氯仿甲醇（95：5）为展开剂展开麦 角生物碱时发现，对同一种生
有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。
对于无色物质，可根据化合物的性质，用物理检 出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射性检出法进行
显色。
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1 物理检出法
1 .紫外光 一般来说，对于未知化合物，展开后在用显色剂以前，都应先
在紫外灯下进行察看。紫外光常用两种波254nm与365nm。 如果化合物能吸收紫外光同时放出荧光，可用此荧光定位。
10
(三)薄层层析中展开剂的选择
主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。 各种展开剂按其极性不同排序为：
烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<酯类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类 <酚类<羧酸
11
选择薄层条件的简图
图2 化合物的极性、吸附剂的活度及展开 剂极性间的关系
Stahl设计的用以选择薄 层条件的简图
13
在具体工作中，展开剂的选择还必须进一 步通过实践，一般可用下列三种方法： (1)查阅文献 (2)微型薄层 ：用小玻片铺上薄层，用各 种经初步选择认为可能应用的展开剂展开， 从而选择适当的展开剂，再用于一般的薄层 层析。用微型薄层，节省材料和时间。 (3)微量圆环技术
14
微量圆环技术
将试样溶液点于已准备好
33
4 生物与酶检出法(bioautography)
生物检出法又称生物自显影法是用生物检定法检出 薄层上具有生物效应的物质如抗生素的方法。基于检 出物质的生物活性，将薄层板与已培养有适当微生物 的琼脂表面接触，并置适宜温度的培育箱内，经过一 段时间后观察抑菌点，有抗生素斑点处的培养基微生 物生长受到抑制，整个琼脂板出现了抑菌点，由此抑 菌点可对该抗生素组分定位。
常用的薄层色谱法以吸附剂为固定相,属于吸附色谱的范畴
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特点
薄层色谱与液相色谱法比较
HPLC
TLC
每次只能分析一个样品
在一块板上点上多个样品 同时进行分离
对样品制备要求高，必须不 用毕一次弃去，可直接用 含可吸留在柱上的杂质，否 样品的粗提物点样 则柱性能受损
可用检测器种类较少
展开后可用多种手段检测
物碱，在薄层板中部的Rf值比在 边缘的Rf值小，称此现象为“边 缘效应”（edge effect）。
展开槽中被展开剂蒸气饱和
后再进行展开就可以消除。
图5 在未饱和展开槽中薄层板上出现 的“边缘效应”
22
➢ 普通展开槽 ➢ 双底展开槽 ➢ 水平展开槽Leabharlann 3.展开槽4.展开方式
(1)近水平展开：将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.5cm，薄层上端垫高使薄层 与水平成5-10º的角。
2. 碘 元素碘的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定
位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态， 有利于薄层的进一步处理。 3. 水
水可作为一种非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，当许多憎水性 化合物展开后，用水喷薄层板，对光观察，在半透明的薄层板上，显 出白色不透明的斑点。
2.化学检出法
分离度。 ➢ 用粘度太大的溶剂时需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘度，加
快展开速度。 ➢ 例如环己烷-丙酮-二乙胺-水（10:5:2:5）这个系统中，
水是极性大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以降 低作分用离，物少质量的二乙Rf值胺，的丙加酮入起控着制混了匀展整开个剂系的统pH及值降以低使展分开离剂后粘的度斑的 点不致拖尾，分离清晰。
(2)上行展开：将点样后的薄层放在盛有展开剂的直立型的展开槽中，展开剂由 薄层下端借毛细管作用上升至前沿。
(3)下行展开 (4)双向展开
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薄 层 板
上行法
层
析
缸
薄层板
展开剂
玻璃板 上涂吸附剂层
SiO2 Al2O3
下行法
层
析
缸
薄层板
滤纸条 展开剂
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几种新型的展开技术
(1) 程序蒸气展开（Vapor-programmed，VP） (2) 圆形色谱（Radial Chromatography） (3) 热板色谱(Hot plates Chromatography) (4) 多次展开（Multiple Development ） (5) 程序多次展开（programmed Multiple Development，
(2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿色背景 上显现黄色斑，表示是脂肪族羧酸。
常用的通用显色剂还有：5%磷钼酸乙醇、 碱性高锰酸钾溶液、 硝酸银-氢氧化铵试剂、荧光显色剂等。
2 专属性显色剂
指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。
例如2%2，4-二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120℃加热10分钟，醛 酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑。
相对比移值，即相对于某一物质x的Rf值，用Rx表 示。
其定义为：Rx＝组分的Rf值／物质x的Rf值 组分A相对于物质B的“相对比移值” RB =a/b