DNA测序技术的发展历史与最新

Solexa测序技术路线：
Solexa测序技术的特点
①通量高。目前一台机器在两周内最高可产出 360G 的数据; ②准确率高。≥98. 5% ，同时也有效地解决了多 聚重复序列的读取问题; ③成本低。低于传统Sanger 测序技术成本的1% ; ④DNA 序列的读取长度不断增加，当前单条序列读 长可达到150 bp; ⑤可以进行Pair-end( PE) 双向测序，PE 文库插入 片段大小范围可由150 bp 到10 kb。正确选择插 入片段长度有利于高重复序列含量基因组的组装， 这进一步扩展了该技术的应用范围。
454测序仪技术应用简介
Solexa测序技术的原理
基本原理是将基因组DNA打碎成约100 200个碱基的小片段,在片段的两个末端加 上接头( adap ter) 。将DNA片段变成单链 后通过接头与芯片表面的引物碱基互补而 使一端被固定在芯片上。另外一端随机和 附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成 桥状结构。通过30轮扩增反应,每个单分子 被扩增大约1 000倍,成为单克隆的DNA簇, 随后将DNA簇线性化。
荧光自动测序技术
荧光自动测序技术基于Sanger原理,用荧光 标记代替同位素标记,并用成像系统自动检 测,从而大大提高了DNA测序的速度和准确 性。
第二代DNA测序技术
罗氏454 公司的GS FLX测序平台
Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer测序平台
AB I公司的SOLiD测序平台
454测序技术的特点
①速度快
一个测序反应耗时10 h，获得4 － 6 亿个碱 基对。比传统的Sanger 测序的方法快100 倍;
②读长长 单条序列的读长平均可达到450 bp; ③通量高 每个反应可以得到超过100万个序列读长; ④准确度高 读长超过400 bp 时，单一读长的准确性可 以超过99% ; ⑤可以进行Pair-End 测序研究。
在2002年4月，美国 《科学》杂志 ，登载 了一篇长达14页的论 文尤其引人注目—— —《水稻（籼稻）基 因组的工作框架序列 图》。 2004年12月，水稻基 因组“精细图”全部 完成
2004年12月10 日，中国科学家 在世界上率先完 成的家蚕基因组 “框架图”及基 因组生物学分析 成果在世界科学 类权威的学术期 刊—— 《Science》杂 志上发表。
扩增：每个独特的片段在自己的微反应器 里进行独立的扩增(乳液PCR, emulsion PCR) ,从而排除了其它序列的竞争。整个 DNA 片段文库的扩增平行进行。对于每一 个片段而言,扩增产生几百万个相同的拷贝。 乳液PCR终止后,扩增的片段仍然结合在磁 珠上。
测序：携带DNA 的捕获磁珠被放入PTP板中进行 测序。PTP孔的直径(29μm)只能容纳一个磁珠 (20μm) 。放置在4个单独的试剂瓶里的4种碱基, 依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每 次只进入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放 一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP 硫酸化酶和荧光 素酶的作用下,释放出光信号,并实时地被仪器配 置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模 板进行配对,就会捕获到一分子的光信号;由此一 一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱基 序列。
2009年12月13日， Nature杂志刊登了由 深圳华大基因研究院 领衔完成的大熊猫基 因测序。
DNA测序技术的发展历史与最 新进展
主讲人：金瑞营
第一代DNA测序Байду номын сангаас术
三种测序方法的原理
第二代DNA测序技术
三个测序平台的工作原理及操作步骤
第三代DNA测序技术
单分子测序的特点及应用前景
第一代DNA测序技术
成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。 ●1977年Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定 DNA序列的方法。 ●同一时期, Sanger发明了双脱氧链终止法 ● 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA 测序带入自动化测序的时代。
这些技术统称为第一代DNA测序技术。
化学降解法
454测序技术具体步骤
文库准备：将基因组DNA 打碎成300 -800 bp长的片段(若是snRNA或PCR产物可以直 接进入下一步) ,在单链DNA的3′端和5′ 端分 别连上不同的接头。 连接：带有接头的单链DNA 被固定在 DNA 捕获磁珠上。每一个磁珠携带一个单 链DNA片段。随后扩增试剂将磁珠乳化,形 成油包水的混合物,这样就形成了许多只包 含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
在该方法中,一个末端被放射性标记的DNA 片段在5组互相独立的化学反应中分别被部 分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱 基。因此生成5组放射性标记的分子,每组混 合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度 取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片 段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影 来检测末端标记的分子。
双脱氧链终止法
原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧 核苷三磷酸( dNTP,其中的一种用放射性P32标记) 存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例 引入4种双脱氧核苷三磷酸( ddNTP) ,因为双脱氧 核苷没有3′ -OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的 末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链 就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以 各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的 核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳, 分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一 个碱基。经过放射自显影后,根据片段3′端的双 脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
在下一步合成反应中,加入改造过的DNA聚合酶和 带有4种荧光标记的dNTP。在DNA合成时,每一 个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐,激 发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫描反应板表 面,在读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的 核苷酸种类后,将这些荧光基团化学切割,恢复3′端 黏性,随后添加第二个核苷酸。如此重复,直到每 条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮 收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA 片段的序列。