PCR引物设计原则之个人心得篇(好文章)
定量PCR 引物、探针设计原则
定量PCR 引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→目的DNA第二步：保持GC）?典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp?引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
?探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
PCR引物的设计原则
PCR引物的设计原则PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为18~27mer。
引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.碱基随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C 富集序列区错误引发。
6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。
PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。
1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。
为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。
2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。
3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。
二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。
4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。
因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。
1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。
这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。
2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。
3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。
4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。
5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。
引物的互补性会干扰PCR反应的进行。
6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。
7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。
8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。
关于PCR总结
PCR总结若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。
酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。
引物的设计原则1．引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。
2．基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。
四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。
尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。
3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp 的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
4．引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。
由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。
若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。
通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。
5．3’末端：引物的3’端（羟基端）是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。
引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
6．溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的T m值（不同序列的DNA，Tm值不同。
DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
），其差别不应大于5℃。
扩增产物与引物的T m值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有效的变性。
8. 引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。
9．引物的简并性：引物的3’端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
PCR引物设计的基本原则
PCR引物设计原则设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理：①引物长度一般引物长度为18~30碱基。
总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。
有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。
为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。
引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。
② GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。
③退火温度退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。
一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。
④避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。
在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。
1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。
1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。
1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。
可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。
此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。
2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。
2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。
2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。
探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。
此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。
2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。
探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。
此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。
总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。
在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。
QRT-PCR引物设计PROTOCOL
QRT-PCR引物设计概述：在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA 污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。
下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享之！要求：1. 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
2. GC=30-80%；3. 应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
引物的3’端最好不为G或/和C。
引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.5.6.7.8. PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp）；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在；而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响；至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的；关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用；9. 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
设计方案：I. 跨内含子设计方案（尽量不采用，如果方法II没有合适的引物，在考虑I）1. 上下游引物分别在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA污染；FPII．跨外显子设计方案（尽量采用这种方案设计）1. 上游（A）或下游（B）或上下游引物（C）跨在两个外显子上，如下图所示，这样设计的引物不能从基因组DNA扩增,从而消除基因组DNA污染的影响（这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好，同时注意：引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，<8bp左右）。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。
PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。
因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。
以下是PCR引物设计的原理及原则。
一、PCR引物设计的原理1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。
引物过短可能导致非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。
较长引物（20-25个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。
引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。
此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的熔解温度。
引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目标DNA序列结合的特异性和稳定性。
4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要影响。
引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合能力不佳。
二、PCR引物设计的原则1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。
在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。
2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。
3.引物序列中避免重复序列：引物序列中避免过多的重复序列，以免引发非特异性引物结合。
4.引物催化部位特异性：引物的催化部位（3'端）应具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
5.引物的Tm值匹配：引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以确保引物在反应温度下与模板DNA序列结合的稳定性。
引物设计教程范文
引物设计教程范文引物设计是指在科学研究或实验中使用的引物（primer）的设计过程。
引物是DNA或RNA分子链的短片段，用于PCR扩增、DNA测序、基因克隆等实验中的特定目的。
一个好的引物设计能够确保实验的成功和可靠性。
本文将介绍引物设计的基本原则和一些常用的引物设计工具。
引物设计的基本原则如下：1.引物长度：通常，引物的长度应在18-30个碱基对之间，引物过长容易造成非特异性扩增，引物过短则可能无法扩增特定片段。
2.引物序列特异性：引物应该与目标序列特异结合，以避免非特异性扩增和干扰。
3.引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
高GC含量可以增加引物和目标序列的结合力，但过高的GC含量会增加引物的结合特异性。
4.引物的熔解温度（Tm）：引物的Tm是指其在扩增反应中解离的温度。
引物的Tm应在50-65摄氏度之间，以确保扩增反应的稳定性。
5.引物序列间的配对：PCR扩增一般使用一对引物，它们应该分别在目标序列的两侧配对。
引物之间的配对能够确保正确扩增目标片段。
除了基本原则外，科研人员还可以使用一些引物设计工具来辅助设计引物。
1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计工具，它可以根据用户提供的目标序列和一些参数来自动设计引物。
用户可以指定引物的长度、GC含量、Tm等参数，并且可以根据需要设计多对引物。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）开发的一款在线引物设计工具。
它使用BLAST算法来确保引物的特异性，用户只需要提供目标序列即可。
使用这些工具进行引物设计时，用户通常需要提供目标序列的基本信息，如序列长度和DNA/RNA序列。
在设计引物时，可以根据实际需求进行不同参数的设定，以获得最佳的引物设计结果。
总之，引物设计是科学研究和实验中必要的一步，一个好的引物设计能够增加实验的可靠性和成功率。
遵循引物设计的基本原则和使用合适的引物设计工具，能够有效地设计出满足实验要求的引物。
PCR引物的设计
PCR引物的设计PCR引物设计是体现PCR技术的关键步骤之一，对于PCR反应的成功与否起到决定性的作用。
引物设计的好坏直接影响PCR反应的特异性、灵敏度和效率。
合理设计的引物可以确保所需基因片段的特异扩增，并可以避免非特异扩增或PCR产物的假阳性结果。
下面将从引物设计的基本原则、引物的性质、引物设计的策略以及引物设计的软件工具等方面进行详细阐述。
引物设计的基本原则包括：正反引物要在目标DNA序列上配对，引物长度应在20-30个碱基对之间，GC含量应在40-60%，引物5'端不应含有GC二聚体，引物特异性要求至少在最末3个碱基对与DNA序列完全匹配。
此外，引物之间的距离和长度应与目标序列相关，以满足所需扩增的目的。
引物的性质是影响引物设计和PCR扩增结果的重要因素。
引物的性质包括引物的长度、GC含量、距离和Tm值等。
引物的长度通常在20-30个碱基对之间，以确保特异性和较高的扩增效率。
引物的GC含量应在40-60%，高GC含量可以增加引物与靶序列的结合性，但是过高或过低的GC含量都会影响引物的扩增效率和特异性。
引物之间的距离应在100-300碱基对之间，以确保引物的特异性和稳定性。
引物的Tm值应相似，通常要求差异在±2℃以内，以确保引物都在同一温度下反应。
引物设计的策略有多种。
其中一种常用的策略是根据目标基因的序列设计引物。
首先，从目标序列中选择一个适当的区域，要求该区域具有足够的变异度和特异性。
然后使用引物设计软件根据目标序列设计出一对近似匹配但不相交的引物。
此外，还可以使用引物设计软件目标序列周围的同源序列，多个同源序列用于设计同一基因的特异性引物。
另外一种常用的策略是通过引物库设计引物。
可以从已有的引物库中选择合适的引物，这些引物可能已经在实验中被证实具有优秀的扩增性能。
此外，还可以通过进行引物库筛选，使用特异性引物选择和筛除目标序列来设计引物。
引物设计的软件工具也是PCR引物设计的重要辅助工具。
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PCR引物设计原则之个人心得篇
记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的PCR
条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是
有许多需要注意的地方。PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的
地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个
时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知
模板序列的情况下进行。
与蛋白质组学一线专家面对面，赶快报名参加第二期蛋白质组学技术与应用高级培训班！
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软
件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引
用有一些需要注意的基本原理：
① 引物长度
一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重
要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此
有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度
不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最
短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。
由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的
稳定双链模板的速率越小。
② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值
应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的
A、T或G、C尾巴。
③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火
温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退
火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR
的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间
变化。
④ 避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测
估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△
G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-
脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
⑤ 与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个
地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进
行检测，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。选择Align two sequences
(bl2seq)，如下图。
BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。
将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，
并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否
都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就
不用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中
是否有多个同源位点了。
可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，
那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形
成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物
输入对产物片段进行预测。
⑥ 引物末端
引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过
3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能
有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不
能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码
子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
⑦ 引物的二级结构
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级
结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续
互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补
重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的
同源性或互补性。
⑧ 为了下一步操作而产生的不完全匹配
5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引
物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋
白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列
等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但
是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。
很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载
体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结
一些为了亚克隆所要设计的序列。
a 添加限制性内切酶酶切位点
添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点
是六个碱基，另外在酶切位点的5’端还需要加2～3个保护碱基。但是不同的酶
需要的保护碱基数目是不相同的，例如：SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1
个，NotⅠ需要2个，Hind Ⅲ 3个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小
技巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》。里面一些规则是所有表达
都通用的。
有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切
酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐。
有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行
会使出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。
b LIC添加尾巴
LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分
的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC 法制备的pET 载体有不互补的
12–15 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引
物5'序列要与LIC载体互补。T4 DNA 聚合酶的3'→5'外切活性经短时间即可在
插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产
物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。
c 定向TA克隆添加尾巴
在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明
想出来的。但是后来人们发现TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来
Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。
因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有
方向”了。
d In-Fusion克隆方法
这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的，2004年在生物通可着实风
光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。此技术
就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物
的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入
到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。
这种方法特别适合大批量的转化。
这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发email推
荐给生物通。说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。
如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入
NotⅠ的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，
且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火
温度相差不宜太远。因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符
合。在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一
原则，要试一试才能知道能否行得通了。（生物通谢菲）