分子生物学_研究方法(上)
现代分子生物实验技术PPT(上)
3. Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(Log值）存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的 标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数， 横坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准 曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合 适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有 重nomic library: a storable collection of cellular clones that contains copies of every sequence in the whole genome inserted into a suit基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功 能和调控机理。
常用的琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 Tris-乙酸 （TAE） 工作溶液 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/L EDTA 贮 存 液（1000 ml） 50×: 242g Tris 57.1ml冰乙酸 100ml0.5mol/L EDTA （pH8.0） 10×: 108g Tris 15.5ml85%磷酸（ 1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 5×: 54g Tris 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
核酸电泳技术要点
• 制备凝胶：准确称取琼脂糖粉末，以电泳缓冲液（ TAE/TBE）溶解，微波加热至沸腾，待温度降至约60℃ 时，加EB液，混匀后，迅速倒入预先制好胶槽内。 • 电泳：随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分 子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的 DNA可以5-20 V/cm电压电泳。
分子生物学的研究方法
添加标题
应用：生物信息学、药物筛选、环境监测、食品 安全等领域。
添加标题
优势：高灵敏度、高特异性、高通量、低成本等。
分子生物学研究 的应用领域
疾病诊断和治疗
靶向治疗：针对特定基因或蛋 白质的药物设计，提高治疗效 果和减少副作用
基因检测：通过检测基因突变， 预测疾病风险和诊断遗传性疾 病
免疫疗法：利用免疫系统攻击 肿瘤细胞，已成功应用于多种
个体化用药：基 于分子生物学研 究，实现个体化 用药，提高治疗 效果并降低副作
用。
生物进化研究
分子生物学研究方法在生物进化研 究中的应用
分子生物学研究方法在生物多样性 研究中的应用
添加标题
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添加标题
添加标题
分子生物学研究方法在物种起源和 演化方面的应用
分子生物学研究方法在古生物研究 中的应用
基因表达分析
基因表达谱分析：通过高通量测序技术，对特定组织或细胞中的基因表达情况进行全 面检测和比较，了解基因的表达差异和调控机制。
实时定量PCR：通过荧光染料或探针标记的特异引物，对特定基因进行实时荧光检 测，实现对基因表达的定量分析。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）：通过与特定抗体结合的染色质片段，检测与DNA结 合的蛋白质，了解基因转录调控过程中的蛋白质相互作用。
跨学科研究的融合和创新
分子生物学与其他学科 的交叉融合，如物理学、 化学、工程学等，为研 究提供新的视角和工具。
创新的研究方法和技术在 分子生物学中的应用，如 人工智能、基因编辑等， 为解决复杂问题提供更多 可能性。
跨学科研究的融合和创 新有助于打破学科壁垒， 促进知识交流和成果转 化。
未来发展方向：加强跨 学科合作，推动技术创 新，拓展分子生物学的 研究领域和应用范围。
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
现代分子生物学(第三版)课后答案 第五章分子生物学研究方法(上)
第五章分子生物学的研究方法（上）西南大学生命科学学院09级XX(仅代表个人观点)1，哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生和发展？答：1，确定遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；2，DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制的提出；3，中心法则，操纵子学说的提出和密码子的破译；4，重组工具酶的发现；5，运载体重组质粒的发现。
2，如何理解PCR扩增的原理和过程。
答：原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
过程：1，变性，将DNA在临近沸点的温度下加热使变性，双链打开；2，退火，引物与模版的相结合；3，链的延伸，DNA合成。
3，简述定量PCR的原理和过程。
答：实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接头孤傲管盖，使其中的荧光探针被激发。
一逛探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合之后，才能被激发发出荧光。
随着新和成DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光增加。
4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？答：基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。
应用：主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。
cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。
应用：筛选目的基因、大规模测序、金银芯片杂交等功能基因组学的研究。
5，基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的作用和用途。
答：1，RACE技术，用于在已知cDNA序列的基础上克隆5’端和3’端缺失的序列；2，应用cDNA差示分析法克隆基因，在没有任何探针的情况下，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDAN两端接头的方法特异性的扩增目的基因片段。
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
12-分子生物学研究方法
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两端具有attL1和attL2位
点，目的载体中含有
attR1和attR2位点，通
过重组形成新的位点
attB1和attB2，从而将
目的基因亚克隆到表达载
体中。
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双向电泳
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等电聚焦：蛋白质在含有载体两性电解质形 成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。 蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有 电荷，因此可以在电场中移动，当蛋白质迁 移至其等电点位置时，其净电荷数为零，在 电场中不移动，据此将蛋白质分离。
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直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记。由于直 接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号，省去了繁 琐的免疫荧光反应，不再需要购买荧光抗体，也由于近 年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高，直接 标记的荧光探针越来越成为首选，其荧光强度和信号大 小都易于在普通荧光显微镜下观察，操作过程中也不需 要严格避光，使FISH过程变得简便而易于操作。缺点 是信号不能放大。43●●●
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分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学的研究方法例题和知识点总结
分子生物学的研究方法例题和知识点总结分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。
它的研究方法多种多样，下面我们将通过一些例题来深入理解这些方法，并对相关知识点进行总结。
一、核酸提取与纯化核酸包括 DNA 和 RNA，是分子生物学研究的重要对象。
提取和纯化高质量的核酸是后续实验的基础。
例题：从植物叶片中提取总 DNA，需要经过哪些步骤？知识点：1、破碎细胞：使用机械研磨、酶解法等破坏细胞壁和细胞膜，释放出核酸。
2、去除杂质：通过加入蛋白酶 K 去除蛋白质，用酚/氯仿抽提去除酚类、多糖等杂质。
3、沉淀核酸：常用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，离心后获得核酸沉淀。
4、洗涤和溶解：用 70%乙醇洗涤沉淀去除盐分，干燥后用适当的缓冲液溶解。
二、PCR 技术（聚合酶链式反应）PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术。
例题：设计一对引物用于扩增某基因的特定片段，需要考虑哪些因素？知识点：1、引物长度：通常为 18 25 个核苷酸。
2、碱基组成：G ＋ C 含量在 40% 60%之间，避免形成稳定的二级结构。
3、特异性：引物要与目的基因特异性结合，避免与其他序列有过多的同源性。
4、退火温度：根据引物的碱基组成计算退火温度，以保证扩增的特异性和效率。
PCR 的基本步骤包括：1、变性：高温使双链 DNA 解离为单链。
2、退火：降低温度，引物与单链 DNA 结合。
3、延伸：在 DNA 聚合酶的作用下，从引物 3'端开始合成新的DNA 链。
三、基因克隆基因克隆是将目的基因插入到载体中，导入宿主细胞进行复制和表达。
例题：简述构建重组质粒的过程。
知识点：1、目的基因获取：可以通过 PCR 扩增、从基因文库中筛选等方法获得。
2、载体选择：常见的载体有质粒、噬菌体等，要根据实验需求选择合适的载体。
3、酶切和连接：用相同的限制性内切酶分别切割目的基因和载体，然后用 DNA 连接酶将它们连接起来。
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(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分 认识了遗传信息的流动现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
1 DNA操作技术
• DNA分子的切割与连接 • 核酸分子杂交 • 凝胶电泳 • 细胞转化 • 核酸序列分析 • 基因的人工合成 • 基因的定点突变 • PCR扩增 • 基因敲除
1.1 核酸的凝胶电泳
原理： 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；
聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳 用途：鉴定重组DNA分子
1.2.3 植物转基因的方法 (1)Ti质粒介导 (2)电转化法 (3)基因枪法
1.3 核酸的分子杂交
1.3.1 放射性同位素技术
同位素：原子序数相同而质量不同的元素。
放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳 定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位 素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α 射线、β -射线和γ -射线等，同时从不稳定同位素 变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用 的是放射性同位素。
1.3.2 分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。
Southern杂交：将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Western杂交：将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应。
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
基因工程的主要内容或步骤
“分---切---连---转---筛”
（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的 基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目 的基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克 隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。
(t1/2 = 4.5×109a)
放射性强度的探测
（1）盖革计数器（Geiger counter tuber）， 闪烁计数器。
（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在 黑暗中，-70℃，曝光。
放射性分子的制备：核物理，化学，生化反 应，生化分离技术
核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备DNA放射性探针
放射性的衰变类型 α -射线：带正电荷的高速粒子流 β -射线：带负电荷的粒子流 γ -射线：光子流
分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质
元素名称 半衰期 12.1年 5700年 14.3天 87.1天 5.8年
147N + 10n → 146C + 11H 146C → 147N + 0-1e 23892U → 20682Pb + 842He + 60-1e
1.2 转基因方法
1.2.1 细菌转基因的方法 (1)结合（conjugation） (2)转化（transformation）(常规转化、电转化等) (3)转染（transfection） (4)转导（transduction）
1.2.2 动物转基因的方法 (1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。 (2)电导转基因法 (3)逆转录病毒介导法 (4)胚胎干细胞介导法 (5)精子载体法
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶 浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低， 孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
第五章
分子生物学研究方法（上）
本章主要内容
常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术
引言
重组DNA技术发展史上的重大事件
(1) 40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了
遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋 白质。
(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问 题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留
蛋白质与核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图
琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1000个碱基对
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5ˊ到3ˊ方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口
反转录酶
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5ˊ-OH末端（进行末端标 记实验或用来进行DNA的连接
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ 噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。