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吸烟对口腔黏膜中p65NFκB，p38促分裂原活化蛋白激酶，和可诱导一氧化氮合酶表达水平的影响中文翻译：罗旋中文翻译审校：徐海淞穆雄铮作者：Aysenur Meric,MD,Berke Ozucer,MD,Orhan Gedikli,MD,Yalcin Yildirim,MD, Arzu Yasemin Korkut,MD,Volkan Kahya,MD,Sabri Baki Eren,MD,and Adnan Somay,MD摘要：目的：吸烟在口腔癌的发展中有很重要的作用，然而，其在口腔黏膜的致癌分子机制还未阐明。

本研究目的就是要检测对比吸烟和不吸烟志愿者的口腔黏膜中p65NFκB，p38促分裂原活化蛋白激酶，和可诱导一氧化氮合酶表达水平。

方法：从78位志愿者口腔颊侧取到黏膜。

吸烟组再分为轻度吸烟组（＜40盒年）和重度吸烟者（≥40盒年）。

组织经石蜡包埋后，用免疫组化方法由特异性抗体检测p65NF-κB,p38 MAPK,及iNOS的表达水平，结果由染色的面积和深度评价。

结果：第一组由40位非吸烟者组成，52.5%女性，47.5%男性，平均年龄46.4岁。

第二组由38位吸烟者组成（20位轻度吸烟者，18位重度吸烟者）39.5%女性，60.5%男性，平均年龄48.9岁。

吸烟组在p65NF-κB,p38MAPK,及iNOS的表达率所对应的的免疫组化染色值明显高于非吸烟组（p<0.001）。

p65NF-κB，p38MAPK,及iNOS表达率最高的是重度吸烟者组的口腔黏膜，iNOS和p65NF-κB的表达在重度吸烟者组明显高于轻度吸烟者组（p<0.001及p<0.005）。

p38MAPK的表达在重度吸烟者组虽高于轻度吸烟者组，然而没有统计学差异（p>0.005）。

结论：本研究首次阐明了在吸烟者的口腔粘膜中p65NF-κB及p38MAPK的表达明显增高，并且p65NF-κB，p38MAPK,及iNOS在口腔粘膜的表达水平与吸烟程度相关。

关键词：吸烟，口腔黏膜，转录因子κB，促分裂原活化蛋白激酶，可诱导一氧化氮合酶口腔癌是世界发生率第五的恶性肿瘤。

流行病学调查已阐明吸烟在头颈部癌的发展中起主要作用[1，2]。

近期研究表明，由于吸烟的烟雾途径上呼吸道，烟雾中尼古丁及其他有害物质具有氧化损伤效应，产生细胞毒性，造成角蛋白细胞的坏死，导致口腔黏膜的癌前病变甚至癌症的发生[3]。

但其向恶性转化的分子机制仍未阐明。

p65转录因子κB（p65NF-κB）是一种普遍存在的转录因子，介导炎症和抗宿主反应的相关基因的表达[4]。

p65NF-κB同样具有抗凋亡，维持存活，和促进细胞生长的作用。

自由基和氧化损伤会导致p65NF-κB异位，引起诸如可诱导一氧化氮合酶（iNOS）基因的表达激活。

P38促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）参与了NF-κB的激活，且体外实验中证实能够增加iNOS的表达[5，6]。

iNOS的激活会产生高浓度的一氧化氮（NO），这对粘膜是有毒性的，在癌症发生和肿瘤形成中也起了重要作用[7]。

之前的研究也表明p65NF-κB，p38 MAPK,及iNOS通路参与DNA损伤[5-10]。

本实验观察吸烟者和非吸烟者口腔黏膜中p65NF-κB，p38MAPK,及iNOS的表达水平，来探讨吸烟对于这些有关细胞毒性、DNA损伤、致癌作用的因子表达的影响。

方法：组织的收集：本实验所进行研究全部在Bezmialem Vakıf大学医学院，耳鼻喉科进行，遵循赫尔辛基宣言，所有行为均经许可，并经伦理委员会同意，遵守国际卫生医药研究准则。

实验设计遵循独立、随机、双盲原则。

志愿者将被详细地问及饮酒史，局部口腔制剂使用情况，口内感染，口腔破损，牙齿疾病，系统疾病以及口腔黏膜肿瘤史。

任何一项阳性将被剔除本研究。

每一位志愿者都提供了年龄、吸烟史、吸烟持续时间及盒年数据。

吸烟者又被划分为两个亚组：轻度吸烟者小于40盒年，重度吸烟者大于40盒年。

口腔黏膜的组织样本是经1%利多卡因局部浸润麻醉后局部打孔活检取到的。

免疫组化分析：组织块茎甲醛固定，石腊包埋。

每一块样本都经光镜检查，60℃孵育过夜。

梯度酒精脱水，样本用去离子水和磷酸盐缓冲液漂洗10分钟，然后用含2%胰酶和50mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH=7.5）37℃孵育15分钟，再用磷酸盐缓冲液漂洗一次。

样本周围用蜡笔（Dako,Glostrup,Danmark）画出范围，在3%H2O2中孵育15分钟阻断内源性过氧化物酶活性。

然后在p65NF-κB（RB1639R7，Neomarkers Lab Vision,Fremont, CA），iNOS（RB1605R7，Neomarkers Lab Vision,Fremont,CA），p38MAPK（Vector Laboratories，Burlingame,CA)抗体中孵育。

辣根过氧化物酶/3-氨基-9-乙基咔唑做为二抗标记。

每个志愿者的样本都经过光镜检查。

根据抗体提供商所提供的数据，以口腔黏膜切片标本作为对照。

p65NF-κB、p38MAPK、iNOS的抗体都做了阴性和阳性的对照。

相应抗体染成功的切片作为阳性对照，未加一抗染色的切片作为阴性对照。

根据片子染色后扩散情况，将结果分为如下等级：0，未被染色；1，染色范围小于25%；2，染色范围介于25%~50%；3，染色范围介于50%~75%；4，染色范围大于75%。

另一种染色标准是介于染色深度：0，未被染色；1，微弱但可查觉得染色；2，明显的染色；3，之前报道中[11]提到的浓重的染色。

所有数据都以染色的范围和深度来记录（等级评分0~7）。

统计学分析：数据经过χ2检验，单因素方差分析，tukey comparison test检验得出统计分析结果。

所有的实验组均求出均数和标准差。

以P<0.05为可接受的统计学差异界值。

结果：本实验中一共有78位志愿者，分为两个主要实验组。

第一组由40位非吸烟者组成，21位女性（52.5%），19位男性（47.5%）。

平均年龄47.45岁。

第二组是由38位吸烟者，15位女性（39.5%），23位男性（60.5%）平均年龄48.92岁。

第二组进一步分为两个亚组：20位吸烟者小于四十盒年（20.95），和18位大于四十盒年，两组志愿者间的年龄和性别没有统计学差异（P>0.05）。

全部样本的免疫组化染色结果汇总于表一。

iNOS蛋白在55%的非吸烟者中表达0级和1级（图1A），相比之下，吸烟者组表达6级和7级（图1D）。

p38MAPK在非吸烟者组中50%表达0级和1级（图1B），而在吸烟者组中，57.9%表达6级和7级（图1E）。

NF-κB 在非吸烟者组中47.5%表达为0级和1级（图1C），吸烟者组中44.7%表达为6级和7级（图1F）。

表一：组一，组二的免疫组化染色评分细节。

图一：免疫组化显示p65NF-κB,p38MAPK,及iNOS的表达情况。

原始放大倍数100倍。

A：第一组，少量吸烟组，iNOS评分为1；B：第一组，少量吸烟组，MAPK/p38评分为1；C：第一组，NF-κB/p65染色阳性评分2；D：第二组，iNOS染色阳性范围评分6；E：第二组，重度吸烟组，MAPK/p38染色阳性，评分6；F：第二组，重度吸烟组，NF-κB/p65染色阳性评分7。

免疫组化染色结果的均值比较于表2。

研究发现，第二组（即吸烟组）p65NF-κB,p38 MAPK,及iNOS的染色值明显高于第一组(P<0.001)。

在吸烟大于四十盒年的重度吸烟亚组的口腔粘膜中检测到的p65NF-κB,p38MAPK,及iNOS的表达率是最高的。

iNOS和NF-κB在重度吸烟组中表达率显著高于轻度吸烟组，统计学差异分别为P＜0.01和P＜0.05。

虽然相比轻度吸烟组，重度吸烟组的p38MAPK表达率较高，但没有明显的统计学差异P>0.05。

表二：组一，组二的免疫组化染色评分。

分值求平均值。

第二组轻、重度吸烟者p65NF-κB,p38MAPK,及iNOS表达都明显高于第一组非吸烟组P<0.001。

重度吸烟者p65NF-κB及iNOS比轻度吸烟者表达显著升高统计学差异分别为P<0.05，P<0.01。

重度吸烟者的p38/MAPK表达虽然比轻度吸烟者高，但没有统计学差异P>0.05。

讨论：口腔癌的发生，是基因和环境因素诸如吸烟、饮酒等共同导致的结果。

口腔黏膜由于直接暴露于高浓度的烟雾中各种有害成分，因而可以作为研究吸烟相关疾病的理想组织。

口腔黏膜可以用来评估组织对于香烟烟雾的反应。

从口腔内壁取一小块组织创伤小而又容易操作，这就便于研究大量的在烟雾暴露和吸烟易感性疾病的发展中起作用的生物标志物[12,13]。

越来越多的研究表明NF-κB在致癌机制中起到重要作用。

Du等人[14]报道p65NF-κB在恶性肿瘤组织中表达明显增高，并且主要定位于核区。

Duffey等人[15]发现p65NF-κB定位于人类咽来源部鳞癌细胞系的细胞核。

人类细胞系的研究表明NF-κB相关因子表达升高能够促进细胞生长，肿瘤浸润，并能够在体外中止对口咽癌的抑制[16]。

在我们的研究中发现p65NF-κB能够随着吸烟的增加表达上调。

这可以帮助解释口腔黏膜癌变的机制。

丝裂酶原活化蛋白激酶途径在肿瘤的发生中起着重要作用，因为他控制着恶性变过程中的中心环节，如细胞生长、凋亡、迁移[17]。

Mishima[18]等人发现MAPK在人的鳞状细胞癌中过表达。

在我们的研究中发现重度吸烟者中，p38MAPK染色非常深，提示其可能参与口腔黏膜的恶性变。

Bentz[19]等人报道在增生、发育障碍、侵袭性癌症的免疫组化染色中iNOS相比对照的正常粘膜有明显的颜色变深。

另一项研究表明，在头颈部鳞状细胞癌中iNOS相比对照正常粘膜的表达明显上调[20]。

iNOS的高表达以及高浓度的NO可能促进了口腔鳞状细胞癌的发生发展[21]。

Sappayatosok等人发现[22]iNOS与口腔鳞状细胞癌的恶性化变和血管化有关.在我们的研究中观察到iNOS在口腔粘膜的表达增加与吸烟有计量依赖效应。

提示iNOS可能在口腔粘膜由于吸烟导致的发育不良退行性变中发挥作用。

Uffort[23]等告诉我们组成性活化的MAPK通路促进NF-κB的激活，引起iNOS表达，加重了恶性发展。

先前的研究提示p65NF-κB,p38MAPK及iNOS由于造成DNA损伤而参与肿瘤形成[24]。

一项体内研究显示NF-κB随着亚慢性暴露于烟雾中，会随着吸烟剂量增加而相应上调[25].在我们的研究中，重度吸烟者组比轻度吸烟者组有显著增高的iNOS和p65NF-κB表达率。

在重度吸烟者组，p65NF-κB,p38MAPK及iNOS的免疫组化染色颜色极深。