最新制药专业生化实验指导书

制药专业生化实验指

导书

《生物化学》实验指导书

适用专业: 制药工程

生物与食品工程学院生物科学系

生物化学实验细则

为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。

1.实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。

2.严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本

实验组的同学不准进入实验室。

3.进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台

后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。

4.实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放

入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。

5.实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方

法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。

6.使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。

7.做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。

8.实验后，要及时完成实验报告。

实验一蛋白质的沉淀、变性反应

（4学时）

目的要求

1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。

原理

在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：

1．可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。

2．不可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

试剂和器材

一、试剂

1. 蛋白质溶液：10ml/组

取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配置。

2. 蛋白质氯化钠溶液：3ml/组

取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。

3. 其余试剂：

硫酸铵粉末（10克/组），饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。

二、器材

试管（15支/组），过滤漏斗（1个），试管架

1个/组，玻璃棒1支/组，沸水浴4台，量筒（总需要20ml ×1,200ml ×1），烧杯（总需要100ml ×2，400×2），试剂瓶（12个/组，附胶头滴管10支/组），移液管（5ml ×6/组，1ml ×3/组），滤纸1盒，洗瓶1个/组，废液缸1个/组，药匙1个/组，移液管架1个/组

操作方法

一、蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用(分级盐析)

3ml饱和硫酸铵过滤滤液球蛋白沉淀硫酸铵粉末搅拌至饱和静置混匀静置10min

3ml蛋白质

氯化钠溶液

滤液清蛋白沉淀

弃去清液水观察

现象

二、蛋白质的不可逆沉淀反应 1. 重金属沉淀蛋白质

2. 酸沉淀蛋白质 1）

2）

6滴蛋白质

观察现象

3. 加热沉淀蛋白质

取5支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位/滴）。

将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，比较各管

的沉淀情况。

思考题

1. 名词解释：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白质等电点沉

淀。

2. 将实验结果写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解

释。

3. 根据实验现象，讨论下列问题：

1）蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？

2）简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。

4. 作为杀菌剂，氯化汞是怎样起作用的？

实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳

（4学时）

目的要求

1. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。

2. 学习利用琼脂糖电泳方法测定DNA片段大小。

3. 学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。

原理

DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。

琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。

表2-1 DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系本实验采用限制性内切酶HindⅢ或EcoRⅠ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，以它们对应的迁移率为