生物化学检验常用技术 ppt课件
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第一节 光谱分析技术
溶剂空白 当显色剂及其它试剂均无 色，被测试样中又无其他 有色粒子时，选用空白溶 剂参比
样品空白 当样品基体溶液有颜色， 而显色剂无颜色且显色剂 也不与样品基体显色时， 选用样品空白
试剂空白 当显色剂或其它试剂有颜 色，而被测试样中又无其 他有色粒子时，选用试剂 空白参比
空白溶液 的选择
第三章 生物化学检验常用技术
学习目标：
掌握分光光度技术、离子选择性电极分析技术、干 化学分析技术、电泳分析技术的基本原理
熟悉生化常规检验仪器的使用方法，及其影响因素 和有关注意事项
了解各种生化常用技术的临床应用，关注生物化学 检验常用技术的发展趋势
第一节 光谱分析技术
光谱分析技术
利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对 物质进行定性或定量的分析技术
Cx=(Ax×Cs)/As
其中Cx和Ax为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近
（三）其它分析方法
包括差示法、多组分混合物分析和利用摩尔吸光系数分析 等方法
第一节 光谱分析技术
二、发射光谱分析法
发射光谱
分子、原子或离子在辐射能的作用下，由基态或低能态 跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射的 形式释放出能量，由此而产生的光谱
一、吸收光谱分析法
（一）分光光度法的基本原理 根据Lambert-Beer定律，当一束平行单色光通
过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶 液浓度成正比
入射光 I0
透射光 I
A=-lg=T -lg I =lgI0
1 =lg =KLC
I0
I
T
第一节 光谱分析技术
• 式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L 为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度
②标准品应有高的纯度，标准液的配制必须准确 ③当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定 ④标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致 ⑤标准溶液设置的浓度范围须足够大，应达到观察拐点
第一节 光谱分析技术
（二）比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
平行操作空白
与样品分析完全相同的操 作步骤，用不含待测元素 的样品溶液进行平行操作
不显色空白
当显色剂和被测试样均有 颜色时，选用不显色空白
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第一节 光谱分析技术
一、吸收光谱分析法 （二）分光光度法在生化检验中的应用
1.对未知化合物进行定性分析 2.对待测物质进行定量测定
（1）标准曲线法 （2）比较法 （3）其它分析方法
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第二节 电化学分析技术
第二节 电化学分析技术
荧光的发射光谱
荧光光谱临床应用：大量具有生物意义的物质，都可采用荧 光分光光度法进行分析测定，如氨基酸、蛋白质、核酸、酶 和辅酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、维生素等
第一节 光谱分析技术
三、散射光谱分析法
散射光谱分析法
利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原 理进行定量分析的方法
（一）散射比浊法
（二）透射比浊法
荧光光谱基本原理：荧光是分子吸收光能量被激发后，从激 发态的最低振动能级跃迁返回基态时所发射出的光
荧 光 固定荧光的发射波 的 长而不断改变激发 激 光（即入射光）的 发 波长，并记录相应 光 的荧光强度，所得 谱 到的荧光强度对激
发波长的谱图称为 荧光的激发光谱
使激发光的波长和 强度保持不变，不 断改变荧光的发射 波长并记录相应的 荧光强度，所得到 的荧光强度对发射 波长的谱图称为荧 光的发射光谱
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第一节 光谱分析技术
（1）标准曲线法
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸 光度成正比关系
待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的 浓度
第一节 光谱分析技术
• 制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
①当测定条件发生变化时（如更换标准品、更换光电池或光 源以及试剂批号不同时），标准曲线应重新绘制
（一）火焰光度法
（二）荧光分光光度法
第一节 光谱分析技术
• 火焰光度法基本原理：指在一定条件下，以火焰 作为激发源提供热能，使样品中待测元素原子化， 由于原子能级的变化，产生特征的发射谱线
热能（火焰）
基态元素M
E
激发态M*
特征辐射
• 火焰光度法临床应用：主要用于血清及尿液样品 中钠、钾的测定
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第一节 光谱分析技术
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第一节 光谱分析技术
三、散射光谱分析法
散射比浊法基本原理：一定 波长的光沿水平轴照射，通 过溶液时，遇到抗原抗体复 合物粒子，光线被粒子颗粒 折射，发生偏转，光线偏转 的角度与发射光的波长和抗 原抗体复合物颗粒大小和多 少密切相关，光强度与复合 物的含量成正比
透射比浊法基本原理：当光线 通过一定体积的溶液时，由于 溶液中存在颗粒（抗原－抗体 复合物）对光线的反射和吸收， 引起透射光的减少，透射光的 透光率和粒子的量成反比。通 过测定透射光的透光率来反映 粒子的量的方法即透射比浊法
• 根据Lambert－Beer定律，当溶液层厚度单位为 1cm，浓度单位为1mol/L时，吸光系数K称为摩尔 吸光系数（ε）
• ε是物质的特征性常数。在固定条件（入射光波 长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光 光度法对物质进行定性的基础
第一节 光谱分析技术
应用Lambert－Beer定律时必须符合3个条件：
灵敏、准确 快速、简便 选择性强 应用范围广
生物化学检验中最基本 和最常用的分析技术
第一节 光谱分析技术
光谱分析技术分类
吸收光谱分析
光谱分析技术
发射光谱分析
散射光谱分析
可见光及紫外分光光度法 原子吸收分光光度法 红外分光光度法 火焰光度法 原子发射分光光度法 荧光光谱法 散射比浊法 透射比浊法
第一节 光谱分析技术
一是入射光必须为单色光 二是被测样品必须是均匀介质 三应是用在L吸am收be过rt程－中Be，er吸定收律物时质必之须间符不合能3个发条生件相：互作用
第一节 光谱分析技术
Lambert－Beer定律的偏离现象：
溶液不是稀溶液时会引起偏离 非单色入射光会引起偏离 光的散射、折射引起的偏离 溶液本身发生化学变化引起的偏离 仪器因素引起的偏离
第一节 光谱分析技术
溶剂空白 当显色剂及其它试剂均无 色，被测试样中又无其他 有色粒子时，选用空白溶 剂参比
样品空白 当样品基体溶液有颜色， 而显色剂无颜色且显色剂 也不与样品基体显色时， 选用样品空白
试剂空白 当显色剂或其它试剂有颜 色，而被测试样中又无其 他有色粒子时，选用试剂 空白参比
空白溶液 的选择
第三章 生物化学检验常用技术
学习目标：
掌握分光光度技术、离子选择性电极分析技术、干 化学分析技术、电泳分析技术的基本原理
熟悉生化常规检验仪器的使用方法，及其影响因素 和有关注意事项
了解各种生化常用技术的临床应用，关注生物化学 检验常用技术的发展趋势
第一节 光谱分析技术
光谱分析技术
利用物质具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对 物质进行定性或定量的分析技术
Cx=(Ax×Cs)/As
其中Cx和Ax为标本管浓度和吸光度，Cs和As分别为标准 管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量 和标本管浓度相近
（三）其它分析方法
包括差示法、多组分混合物分析和利用摩尔吸光系数分析 等方法
第一节 光谱分析技术
二、发射光谱分析法
发射光谱
分子、原子或离子在辐射能的作用下，由基态或低能态 跃迁到激发态，当它们返回基态或低能态时，以辐射的 形式释放出能量，由此而产生的光谱
一、吸收光谱分析法
（一）分光光度法的基本原理 根据Lambert-Beer定律，当一束平行单色光通
过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶 液浓度成正比
入射光 I0
透射光 I
A=-lg=T -lg I =lgI0
1 =lg =KLC
I0
I
T
第一节 光谱分析技术
• 式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L 为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度
②标准品应有高的纯度，标准液的配制必须准确 ③当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定 ④标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致 ⑤标准溶液设置的浓度范围须足够大，应达到观察拐点
第一节 光谱分析技术
（二）比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白， 同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准 品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：
平行操作空白
与样品分析完全相同的操 作步骤，用不含待测元素 的样品溶液进行平行操作
不显色空白
当显色剂和被测试样均有 颜色时，选用不显色空白
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第一节 光谱分析技术
一、吸收光谱分析法 （二）分光光度法在生化检验中的应用
1.对未知化合物进行定性分析 2.对待测物质进行定量测定
（1）标准曲线法 （2）比较法 （3）其它分析方法
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第二节 电化学分析技术
第二节 电化学分析技术
荧光的发射光谱
荧光光谱临床应用：大量具有生物意义的物质，都可采用荧 光分光光度法进行分析测定，如氨基酸、蛋白质、核酸、酶 和辅酶、嘌呤、嘧啶、卟啉、维生素等
第一节 光谱分析技术
三、散射光谱分析法
散射光谱分析法
利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原 理进行定量分析的方法
（一）散射比浊法
（二）透射比浊法
荧光光谱基本原理：荧光是分子吸收光能量被激发后，从激 发态的最低振动能级跃迁返回基态时所发射出的光
荧 光 固定荧光的发射波 的 长而不断改变激发 激 光（即入射光）的 发 波长，并记录相应 光 的荧光强度，所得 谱 到的荧光强度对激
发波长的谱图称为 荧光的激发光谱
使激发光的波长和 强度保持不变，不 断改变荧光的发射 波长并记录相应的 荧光强度，所得到 的荧光强度对发射 波长的谱图称为荧 光的发射光谱
10
第一节 光谱分析技术
（1）标准曲线法
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸 光度成正比关系
待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的 浓度
第一节 光谱分析技术
• 制作和应用标准曲线时应注意下面几点：
①当测定条件发生变化时（如更换标准品、更换光电池或光 源以及试剂批号不同时），标准曲线应重新绘制
（一）火焰光度法
（二）荧光分光光度法
第一节 光谱分析技术
• 火焰光度法基本原理：指在一定条件下，以火焰 作为激发源提供热能，使样品中待测元素原子化， 由于原子能级的变化，产生特征的发射谱线
热能（火焰）
基态元素M
E
激发态M*
特征辐射
• 火焰光度法临床应用：主要用于血清及尿液样品 中钠、钾的测定
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第一节 光谱分析技术
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第一节 光谱分析技术
三、散射光谱分析法
散射比浊法基本原理：一定 波长的光沿水平轴照射，通 过溶液时，遇到抗原抗体复 合物粒子，光线被粒子颗粒 折射，发生偏转，光线偏转 的角度与发射光的波长和抗 原抗体复合物颗粒大小和多 少密切相关，光强度与复合 物的含量成正比
透射比浊法基本原理：当光线 通过一定体积的溶液时，由于 溶液中存在颗粒（抗原－抗体 复合物）对光线的反射和吸收， 引起透射光的减少，透射光的 透光率和粒子的量成反比。通 过测定透射光的透光率来反映 粒子的量的方法即透射比浊法
• 根据Lambert－Beer定律，当溶液层厚度单位为 1cm，浓度单位为1mol/L时，吸光系数K称为摩尔 吸光系数（ε）
• ε是物质的特征性常数。在固定条件（入射光波 长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光 光度法对物质进行定性的基础
第一节 光谱分析技术
应用Lambert－Beer定律时必须符合3个条件：
灵敏、准确 快速、简便 选择性强 应用范围广
生物化学检验中最基本 和最常用的分析技术
第一节 光谱分析技术
光谱分析技术分类
吸收光谱分析
光谱分析技术
发射光谱分析
散射光谱分析
可见光及紫外分光光度法 原子吸收分光光度法 红外分光光度法 火焰光度法 原子发射分光光度法 荧光光谱法 散射比浊法 透射比浊法
第一节 光谱分析技术
一是入射光必须为单色光 二是被测样品必须是均匀介质 三应是用在L吸am收be过rt程－中Be，er吸定收律物时质必之须间符不合能3个发条生件相：互作用
第一节 光谱分析技术
Lambert－Beer定律的偏离现象：
溶液不是稀溶液时会引起偏离 非单色入射光会引起偏离 光的散射、折射引起的偏离 溶液本身发生化学变化引起的偏离 仪器因素引起的偏离