几种主要化学发光物质的发光性
荧光和化学发光的基本知识
化学发光检测方法
1.X光片压片（传统方法） 但曝光时间需要摸索，压片法有一定不便，定量也不准 2.扫描仪 一定波长范围扫描 3.成像仪 Cooled CCD 4.荧光化学发光酶标仪
化学发光在生物学检测中的应用
杂交检测中的信号物质（非放射性标记）： 1. 核酸杂交（Southern&Northern Blot） 2. 蛋白印迹（Western Blot） 3. 酶联免疫（Elisa） 4. 其他：
三、荧光的性质
• 吸收光 • 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓
度、荧光效率
四、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构；
（2）具有一定的荧光量子产率。
一、荧光发生过程
荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳 水化合物或杂环的 特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。
荧光发生是一个3阶段的过程。
① 激发
外源的白炽灯或激光提供的能 量（hvEX）的光子被荧光体吸收， 产生被激发的电子单峰态（S1’ ）。 这个过程是荧光和化学发光的区 别，化学发光的激发态是由化学反 应产生的。
Luminol
和定量 • 激光扫描仪
荧光信号
荧光强度的定量取决于这些参数：吸光度，光径 和稀释浓度，染料的荧光量子的产量，激发光源强度 和仪器荧光采集效率。在稀释溶液或悬液中，荧光强 度与这些参数成线性比例关系。
化学发光
化学发光的原理
某些荧光物质（例如Luminol, C8H7N3O2）可將化学反应中产生的能 量，转化成使分子內的电子由基态（ground state）跃升到激发态（excited state），处于激发态的分子并不穩定，將能量以光的形式释放出來；有的 光波长为可见光范围，但占多数的是荧光（fluorescence）。
化学发光_精品文档
化学发光引言化学发光是一种由化学反应产生的发光现象。
它在许多领域中得到广泛应用，包括生物医学研究、荧光标记、环境检测等。
本文将介绍许多常见的化学发光反应和应用。
化学发光的原理化学发光现象是由于某些物质在受到外界刺激后，经历一系列电子能级跃迁和氧化还原反应，从而产生光子。
这种光子的能量来自于反应中释放出的能量，通常表现为可见光的形式。
化学发光可以通过不同的反应途径实现，但原理大致相同。
常见的化学发光反应1. 芳香酮氧化反应芳香酮氧化反应是一种常见的化学发光反应。
在这种反应中，荧光染料被氧化剂氧化，荧光染料的分子结构发生变化，结果产生发光现象。
这种反应被广泛应用于生物医学研究中，例如免疫荧光染色。
2. 有机过氧化物分解反应有机过氧化物分解反应也是一种常见的化学发光反应。
在这种反应中，有机过氧化物与催化剂接触后分解，产生发光。
这种反应被用于生物检测、环境分析等领域。
3. 金属络合物降解反应金属络合物降解反应是一种利用金属离子与配体反应产生发光的化学反应。
在这种反应中，金属离子与配体形成络合物，随后被氧化剂降解，产生发光。
这种反应广泛应用于分析化学领域。
4. 化学电致发光化学电致发光是一种通过电流刺激产生发光的化学反应。
在这种反应中，电流通过化学发光体系，激发物质发光。
这种反应被广泛应用于电致发光显示器和发光二极管等领域。
化学发光的应用化学发光在许多领域中得到广泛应用。
1. 生物医学研究化学发光广泛应用于生物医学研究中，例如免疫荧光染色、基因检测等。
通过荧光标记分子，可以观察细胞内的分子运动和相互作用，从而了解生物过程的机制。
2. 环境检测化学发光被用于环境检测中，例如水质检测、大气污染监测等。
通过测量发光强度，可以快速准确地检测出环境中存在的污染物。
3. 电子器件化学发光被应用于电子器件中，例如发光二极管、电致发光显示器等。
这些器件利用化学发光的原理，实现了高亮度、高能效、长寿命的发光效果。
4. 安全标识化学发光被用于安全标识中，例如逃生标识、防火标识等。
化学发光和荧光的性质与应用
化学发光和荧光的性质与应用化学发光和荧光是一种具有独特性质和应用的化学现象。
这一现象在科学、工业、医药等领域有着广泛的应用。
化学发光，也称为化学发光分析或化学发光测定，是一种利用化学反应发生时产生的光来分析化合物的方法。
这种方法具有灵敏度高、分析速度快、对样品的数量要求低等优点，因此被广泛应用于环境监测、食品检测、医药研究等领域。
其中，最具代表性的化学发光方法是电化学发光法和化学发光酶标法。
电化学发光法利用电化学反应产生的活性中间体在后续反应中发生化学发光的方法。
这种方法对微量物质具有高度灵敏度，因此常被用于分析无机和有机化合物等微量物质。
化学发光酶标法则是利用化学发光酶标记化合物的方法进行检测。
这种方法处理简单，样品数量要求低，因此在食品、药品、环境检测等领域得到广泛应用。
荧光是一种发射可见光或紫外线的现象。
荧光分为自发荧光和诱导荧光两种类型。
其中，自发荧光通常是一些化合物在受到紫外线、X射线或自然光刺激后，从低能态激发至高能态，然后再退到低能态时发出的光。
而诱导荧光则是在化合物发生化学反应过程中，受到某些物质的激发而发出光。
荧光的应用领域广泛，如环境检测、医药研究、生物成像等。
其中，荧光成像技术则是一种用于研究生物过程和诊断疾病的重要手段。
通过对受体蛋白、细胞膜等进行染色，可以直接观察到这些物质在细胞内的动态变化。
同时，荧光成像技术在抗癌药物筛选、生物传感器等领域也有着广泛的应用。
在化学发光和荧光应用的同时，也面临着一些问题。
例如，荧光染料的选择和性能优化，化学发光方法的准确性和可靠性等。
因此，未来需要通过不断的技术创新和研究来解决这些问题，推动化学发光和荧光技术的应用和发展。
化学发光主流三大类
化学发光主流三大类1 什么是化学发光化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，可以分为直接发光和间接发光。
直接发光是最简单的化学发光反应，有两个关键步骤组成：即激发和辐射。
如A、B两种物质发生化学反应生成C物质，反应释放的能量被C物质的分子吸收并跃迁至激发态C*，处于激发的C*在回到基态的过程中产生光辐射。
这里C*是发光体，此过程中由于C直接参与反应，故称直接化学发光。
2 化学发光的类型化学发光分析测定的物质可以分为三类：第一类物质是化学发光反应中的反应物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂；第三类物质是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。
这三类物质还可以通过标记方式用来测定其他物质，进一步扩大化学发光分析的应用范围。
3化学发光免疫测定技术目前生化免疫技术作为免疫检验中快速发展的一项技术，已得到了临床中广泛认可，尤其是需要通过血液生化免疫检验的部分疾病，检验应用的要求在不断提高，现在临床应用检验技术较广的有酶联免疫技术、放射免疫检验技术等，然而各种检验技术所得的诊断准确度是不同的，尤其是对着疾病变化越来越复杂，对临床检验技术的挑战也在持续增加，需要更可靠高效的技术给予临床支持。
化学发光免疫测定技术可有效识别血液生化检验中的问题，在准确性及可靠性方面具有显著优势，在一定程度上可显著提升生化检验领域的应用效果。
同时病情变化的不确定性为检验技术带来的挑战也可通过化学发光免疫测定的特点解决，即通过提高患者检验的符合率，从而降低漏诊和误诊病例。
除此之外，生化检验对血液系统疾病也有相当的临床诊断价值，所以为了扩大生化检验的适用性，便需要在技术创新上不断做出努力，提高临床检验技术的灵敏度与特异度，为解决患者复杂病情奠定坚实的基础。
我国的化学发光免疫检测仪已经在临床医学当中得到了一定应用，具有较好的发展前景；但同时其发展和应用也存在一定问题，一定程度上会影响临床医学的发展。
当前我国的免疫检测仪原理仍然以酶免疫为主，化学发光免疫检测技术尚未得到彻底掌握与应用；同时国外生产的化学发光免疫检测仪一般只允许使用专门的配套试剂进行检测，如果一味使用国外仪器，则会造成医疗成本上升，免疫检测费用过高。
常见化学发光技术PPT课件
它利用化学反应过程中释放的能 量激发发光物质，使其发出特定 波长的光，从而实现物质的检测 。
化学发光技术的原理
当某些物质被某种能量激发时，这些 物质会吸收能量并跃迁至激发态。
在化学发光反应中，通常需要加入特 殊的化学物质作为发光物质，这些物 质在反应过程中被激发并发出光辐射 。
当这些物质从激发态回到基态时，会 以光子的形式释放能量，从而产生光 辐射。
化学发光反应通常比较简单，所需的仪器 设备相对不复杂，操作简便，检测快速。
缺点
背景光干扰
化学发光反应中可能伴随有背景光的产生 ，对检测结果造成干扰，影响检测的准确
性。
特定性不强
某些化学发光反应可能不仅仅与目标物质 发生反应，也可能与其他类似物质发生反
应，导致检测的特异性不够强。
试剂昂贵且不稳定
某些化学发光试剂比较昂贵且容易分解变 质，需要妥善保存，增加了实验成本和难 度。
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CATALOGUE
化学发光技术的优缺点
优点
高灵敏度
宽线性范围
化学发光技术具有很高的灵敏度，能够检 测到极低浓度的物质，因此在生物医学、 环境监测和食品安全等领域有广泛应用。
该技术线性范围较宽，可以适应不同浓度 的样品检测，减少了样品稀释和浓缩的繁 琐步骤。
非放射性
简单快捷
化学发光反应产生的光子不带电荷，因此 没有放射性污染，对实验人员和环境安全 。
在生物医学研究中的应用
蛋白质组学研究
利用化学发光技术对蛋白 质进行标记和检测，有助 于蛋白质相互作用、定位 和功能研究。
基因表达分析
通过化学发光技术检测基 因表达水平，研究基因调 控和疾病发生机制。
细胞成像与定位
利用化学发光技术对细胞 内分子进行标记和成像， 研究细胞结构和功能。
名词解释化学发光
名词解释化学发光化学发光，即发光化学反应，是一种可以让物质发出可见的光的反应。
可以将它本质上理解成一种能够释放出能量及在体内产生可见光的反应。
这种反应是利用物理和化学原理，将某种物质能量转变为光，或者把光能量转换为化学能量的反应。
这种反应一般不会有任何化学变化，只是产生了光。
发光的过程涉及到4种能量转换：电能转换成光能、分子能转换成光能、电子粒子能转化成光能以及原子能转化成光能。
电能转换成光能时，以电流照射物质，产生发光效果；分子能转换成光能时，分子激发态下发出光；电子粒子能转化成光能时，电子位移时发出光；原子能转化成光能时，原子结构发生变化发出光。
一般情况下，化学发光分为两种：单原子和分子发光。
单原子发光是指原子吸收能量，电子发生跃迁，产生发光现象的发光。
这种发光的本质是由原子的内部结构决定的，即原子的全能级结构，是由电子能级结构决定的能量转换过程。
而分子发光与单原子发光不同，它是一种由分子结构决定的发光反应，也就是说，分子结构内部几个原子之间电子位移产生的能量转换。
一般情况下，在正常情况下，许多物质的原子和分子的结构都不具有发光的能力，所以它们不能发出可见的光，除非遇到其他能量影响，比如热、电或光能等，给它们提供合适的条件，使它们的内部能级发生跃迁，从而产生分子发光或单原子发光的效果。
化学发光在化学领域和生命科学领域有着广泛的应用。
在化学方面，它可以用来检测物质的性质，检测反应物的浓度，分析各种特性，也可用来检测毒素、药物和污染物等；而在生命科学领域，它可以用来影像活体组织，检测蛋白质组成等，也可用来监测疾病、记录遗传资讯等。
综上所述，可以看出，化学发光是一种具有重要价值的化学现象，为各种科学研究提供了重要的实验条件，同时也为社会、工业和经济等领域提供了重要的技术支持。
化学发光技术的基本原理和应用
化学发光技术的基本原理和应用化学发光技术是一种光谱分析技术，可以通过化学反应使样品发生发光现象。
化学发光技术具有较高的灵敏度、特异性和速度，已被广泛应用于食品安全、生物医学、环境分析等领域。
一、化学发光的基本原理化学发光技术的基本原理是利用化学反应过程中释放的化学能转化为光能，使样品发生发光现象。
其中，化学发光主要有三种类型：荧光、磷光和化学发光。
1.荧光荧光是指在一定波长的激发下，某些物质（如蛋白质、核酸等）吸收能量后发射出具有不同波长和较长寿命的电子能级跃迁辐射能量的过程。
荧光通常可以通过紫外线或蓝色激发光源激发产生，其波长范围大约在300 ~ 600 nm，通常在可见光区域呈现出蓝色、绿色、黄色或红色的发光。
2.磷光磷光是指在一定波长的激发下，某些物质（如荧光物质、稀土金属离子等）吸收能量后在较长时间内发生第二次辐射、生成光的过程。
磷光的波长通常在可见光和红外光区域，磷光与荧光的区别在于其发光时间相对较长，通常持续数毫秒至数秒不等。
3.化学发光化学发光是指在某些化学反应中，由于活化能很高而不能生成光谱吸收或吸收的光谱不能足以将其激发至发光态，但是在反应后因为化学能、热能的释放，能够将分子激发至高能态从而产生发光现象。
化学发光的特点是光谱宽、持续时间短（通常在微秒数量级），且发光强度较高。
二、化学发光的应用化学发光技术具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点，因此被广泛应用于生物医学、食品安全、环境分析等领域。
以下是几种常见的化学发光技术及其应用。
1.荧光标记技术荧光标记技术是一种在生物样品中检测特定分子的方法，通过标记样品分子与荧光物质结合，使其在激发下发生发光，并通过荧光检测系统测量荧光强度来定量分析样品中的分子。
荧光标记技术广泛应用于肿瘤诊断、细胞成像、酶学研究等方面。
2.化学发光分析技术化学发光分析技术是一种利用化学反应的发光过程进行定量分析的方法，主要应用于药物分析、环境监测、食品安全检测等领域。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
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・综 述・几种主要化学发光物质的发光性能及其化学发光免疫分析体系尹东光,贺佑丰,刘一兵,沈德存,韩世泉,罗志福(中国原子能科学研究院同位素所五十三室,北京102413) 文章综述了目前国际上免疫分析中应用的几种主要的化学发光物质的结构、发光机理、发光性能和特点以及其免疫分析体系。
目前,在免疫分析领域中应用多种免疫分析方法,其中化学发光免疫分析(C LI A )是将免疫反应和化学发光反应相结合,藉以检测抗原或抗体的技术。
它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发射光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。
C LI A 的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽,可实现全自动化等。
C LI A 具有强大的生命力,在国际和国内倍受临床用户和生物医学工作者的重视。
近十年来C LI A 的发展迅猛,国外已开发出多种化学发光物质,C LI 2A 系统,以及全自动化化学发光仪。
不同的化学发光物质发光机理和发光性能不同,不同的C LI A 系统原理和方法各异。
本文综述了目前国际上免疫分析中应用的几种主要的化学发光物质及其免疫分析体系。
1 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类鲁米诺(luminol )、异鲁米诺(is oluminol )及其衍生物是最早在C LI A 中使用的一种常用的化学发光物质[1-3],它们的结构如下: 这类物质的发光为氧化反应发光,它们在碱性条件下通过辣根过氧化物酶(HRP )催化,被H 2O 2氧化生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体,当其回到基态时发出光子,以鲁米诺为例其发光机理如下:收稿日期:2002-02-06;修回日期:2002-05-23 鲁米诺的发光光子产率约为0.01,最大发射光波长为425nm 。
早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体,但由于标记后发光强度降低而使其灵敏度受到影响,近年来改用HRP 标记抗原或抗体,免疫反应后,利用鲁米诺作发光底物,在发光启动试剂(NaOH +H 2O 2)作用下,鲁米诺发光,发光强度依赖于免疫反应中酶的浓度。
如果不使用增强剂,鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱。
1983-1984年Whitechead 和Thorpe 等首先在上述体系中加入合成的荧光素即一种6-羟基苯并噻唑的衍生物,可以使发光时间延长持续至7min ,光信号强度提高7倍,并降低本底信号强度,将信噪比提高达原来的80倍,此即为Luminol/H 2O 2/HRP/Enhance System 。
1985年发现一些取代酚如对位碘苯酚、1-溴-2-萘酚、对位苯基苯酚、对羟基肉桂酸和4-苯基硼酸等是更好的增强剂,发光的持续时间可延到30-60min ,发光强度至少增加100倍以上。
目前鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物应用于C LI A ,通常采用的体系是Luminol/H 2O 2/HRP/Enhance System ,即用HRP 标记抗原或抗体,以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物,对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂,用NaOH +H 2O 2作发光启动试剂,化学发光反应2min后,光发射强度达到最高峰;20min 后,光强度减少20%。
Amersham 公司的Amerlite 化学发光免疫分析系列商品试剂盒采用Luminol/H 2O 2/HRP/p -iodphenol System 。
2 吖啶酯及吖淀酰胺类如果吖啶环上的C -9碳原子链上取代基且该取代基能与吖啶环上的C -9和H 2O 2形成有张力的不稳定的二氧乙烷,此二氧乙烷分解为C O 2和电子激发态的N -甲基吖啶酮,当回到基态时发出光子,则这类取代吖啶化合物可做为化学发光标记物。
根据取代基的不同,常用作化学发光标记物的吖啶取代物分为两类:一类为吖啶酯,如图Ⅰ所示;另一类为吖啶磺酰胺,如图Ⅱ所示: 图Ⅰ和图Ⅱ中的R ,R ′,R ″可能由烷基、烷烯基、芳基、烷氧基及其取代物等构成,相当于连结吖啶部分和官能团部分的空间手臂,其中R ′,R ″还可能起控制反应动力学和稳定性的作用,如果R ′,R ″含有吸电子基团,则增加反应速率降低稳定性,含有电子授予体基团,则降低反应速率增加稳定性。
X 、X ′、X ″为官能团,它们起的作用是偶联抗原或抗体,并增加化合物在水中的溶解度。
常用做C LI A 的吖啶酯和吖啶磺酰胺化合物[4-8]有下面几种结构: 它们的结构中都有共同的吖啶环,它们的发光机理相同:在碱性H 2O 2溶液中,当其受到过氧化氢离子进攻时,生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷,此二氧乙烷分解为C O 2和电子激发态的N -甲基吖啶酮,当其回到基态时发出一最大发射波长为430nm 的光子,如下图所示: 这类化合物从发光的机理来说,特点是:发光反应中在形成电子激发态中间体之前,联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来,即未发光部分与发光部分分离,因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。
吖啶酯和吖啶酰胺在酸性溶液中(pH 小于4.8)都很稳定,该类化合物及其与蛋白的偶联物在室温下保存4周,其光量子产率不降低;冻干品在-20℃下,可保存一年以上。
但当pH 大于4.8(尤其是在碱性溶液中),吖啶酯和吖啶酰胺类化合物由于发生部分水解而降低其稳定性,水解机理如下图所示。
在水溶液中当其受到OH -进攻时生成一假碱,假碱继续在OH -作用下酯键断裂,最后生成N -甲基吖啶酮,水解过程为不发光的暗反应过程。
吖啶类化合物在水溶液中的水解程度,随pH 值增大而增大;随温度升高而增大。
大多数吖啶酰胺类化合物的稳定性较吖啶酯类高,其原因是由于C -N 键与C -O 键的键级不同,C -N 键大于C -O 键;吖啶酰胺类化合物抵抗水解的能力强于吖啶酯类。
对于吖啶化合物来说,吖啶环及酚环或苯磺酰环上,不连取代基与连接不同取代基其稳定性不同。
通常吖啶环或酚环或苯磺酰环上,连有甲基等取代基的吖啶酯或吖啶磺酰胺,由于空间位阻大的原因热稳定性增加,连有吸电子基团时,因有利于亲核取代反应而使稳定性降低。
吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂,在有H 2O 2的稀碱性溶液中即能发光,具有许多优越性,特别是无须一个催化过程,也不需要增强剂,从而降低了背景发光,提高了信噪比,干扰作用少。
该类化合物作为化学发光免疫分析的发光标记物,还具有其它方面的优点,如光释放快速集中、发光效率高、发光强度大,易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少、标记物稳定,在2-8℃下可保存数月之久,因此吖啶酯或吖啶磺酰胺是一类非常有效的化学发光标记物。
这类化合物发光为闪光型,加入发光启动试剂后,0.4s 左右发射光强度达到最大,半衰期为0.9s 左右。
吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于C LI A ,通常采用的体系是Acridinium ester/H 2O 2系统,即用吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体或抗原,用H NO 3+H 2O 2和NaOH 作发光启动试剂。
有些在发光启动试剂中加入Triton X -100,CT AC ,T ween -20等表面活性剂以增强发光。
例如Cibo C orning 公司的Magic Lite 化学发光免疫分析系列商品试剂盒就是采用这种系统。
3 (金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物能发生化学发光的(金钢烷)-1,2-二氧乙烷[9-15],其结构可以表示如下通式: 其中T 通常为环烷烃金钢烷,起稳定过氧环的作用,X 为烷氧基,它的作用是增加2-二氧乙烷的水溶性,Y 是发光基团(也叫生色基团和荧光发色团),Z 是Y 的保护基团,它与Y 连接的化学键能被碱性磷酸酶断裂,而使Z 与Y 脱离。
当酶促使Z 从分子中脱离后,二氧乙烷分解成两个羰基化合物,一个含T ,另一个含X 和Y,分解反应放出的能量,使Y 激发形成一不稳定的电子激发态中间体,当其回到基态时发出光子。
可以通过选择修饰不同取代基Y 的二氧乙烷,使发射光的波长和光量子数不同,而通过选择修饰T 和X 、Z 可改变二氧乙烷的水溶性和分解动力学性质。
常用于化学发光免疫分析的(金钢烷)-1,2-二氧乙烷有下面几种结构: 在上述分子结构中,螺旋金刚烷构成分子的稳定部分,带有保护基团(磷酸酯或半乳糖吡喃苷)的衍生芳香族结构,则构成易被酶解并在酶解后发光的部分,发光由二氧乙烷断裂分解成为一个激发态的两个羰基化合物。
例如AMPPD 在碱性磷酸酶(AP )作用下磷酸酯基发生水解,脱去一个磷酸基而得到一个中等稳定的中间体AMPPD -(半衰期2-30min ),此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金钢烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子,当回到基态时发出波长为470nm 的光,并可持续几十分钟,其发光机理如下图所示: AMPPD 的特性:(1)在碱性环境下,AMPPD 的非酶解性的水解程度低,即本底低;(2)AMPPD 的热稳定性好,在pH =7.0的水中,30℃时的分解半衰期为142h ,活化能为21.5kcal/m ole ;(3)在pH =9.0时,AP 酶解AMPPD 的速度最快;在pH =9.5时,虽酶解速度略低,但信噪比最低;(4)AMPPD 的酶解发光为辉光型,波长为470nm ,在15min 时强度达到高峰,15-60min 内光信号强度维持一致,变化很小,即使在12h 后仍能测定得出正确结果;(5)加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵(BDM Q )或BS A 等,能明显增强AP 酶解AMPPD 的发光强度,增强因素达100-100000倍。
增强剂的增强机理目前还不非常清楚,在理论上还没有精确的解释,文献上一般认为AMPPD 在中等极化的非质子有机溶剂(如正丁醇,二甲基亚砜等)中的发光强度和检测灵敏度较在极化的质子溶剂中,尤其是水介质中高。
如在水介质中加入增强剂,增强剂包围在AMPPD 分子的周围,可能通过疏水或离子相互作用或二者兼而有之,与AMPPD 酶解产生的发色团结合,使发色团形成一个稳定的构象。
这样使发色团与水分子隔开,从而阻止发色团从激发态回到基态时,非光发射的途径如振动松驰以热能的形式释放全部或部分能量,一些天然的水溶性大分子如水溶性球蛋白BS A 、H AS 等,和人工合成的聚季铵盐如T M Q 、BDM Q 等,它们的分子结构中都含有疏水区,能提供一个疏水性微环境,具有稳定发色基团的作用,从而增强发光强度。
CSPD 和C DP -Star 是继AMPPD 后合成的AP酶解化学发光物质,它们的发光性能优于AMPPD :CSPD 和C DP -Star 较AMPPD 稳定;非酶解性的水解程度更低;酶解速度更快,达到最大光信号只需要相当于AMPPD 时间的一半;且发光信号更强,信噪比更高;CSPD 和C DP -Star 是目前最理想的AP 酶解化学发光物质。