3种转染试剂在SKOV3细胞中转运大质量质粒的效率比较

3种转染试剂在SKOV3细胞中转运大质量质粒的效率比较朱国念;倪银芸;吴思思【摘要】以pAdeasy-1-EGFP作为外源转入质粒,表达绿色荧光蛋白的融合基因,分别用3种转染试剂Lipofectamine 3000、DNA-In CRISPR和FuGENE HD转染SKOV3细胞,比较3种转染试剂在SKOV3细胞中转染大质量质粒的转染效率,以此选择合适的转染试剂解决携带大片段质粒转染效率低的问题.通过观察GFP绿色荧光评估转染效率,并用CCK8法测定3种转染试剂对细胞存活率的影响.实验结果显示Lipofectamine 3000转染效率大于50％,FuGENE HD转染效率约20％,DNA-In CRISPR的转染效率小于5％.Lipofectamine 3000转染SKOV3细胞24 h后细胞活性达到(97.5±2.52)％,FuGENE HD和DNA-In CRISPR转染试剂的细胞活性分别为(89.5±2.43)％和(95.5±3.48)％.对比分析表明,转染试剂Lipofectamine 3000转染效率较高且细胞毒性低,适用于SKOV3细胞进行大质量质粒的转染.%The plasmid DNA pAdeasy-1 EGFP, coding for green fluorescent protein, was transfected into SKOV3 cells via 3 different commercial agents (Lipofectamine 3000, DNA-In CRISPR and FuGENE HD, respectively). We examined the transfection efficiency of reagents to choose the appropriate transfection reagent for solving the problems of large fragment plasmid with lower transfection effi-ciency. Transfection efficiency was determined by green fluorescent protein ( GFP) fluorescence using fluorescence microscope, and cell activity was assessed by cell counting kit-8 (CCK-8). The results showed that the transfection efficiency of Lipofectamine 3000 was more than 50％, the efficiency of FuGENE HD was about 20％, and that of the DNA-In CRISPR was less than 5％. After 24h trans-fection, the cell activities with Lipofectamine 3000, FuGENE and DNA-In CRISPR were (97. 5 ± 2. 52)％,(89. 5 ± 2. 43)％and (95. 5 ± 3. 48)％, respectively. Comparative analysis showed Lipofectamine 3000 had relatively high transfection efficiency with mini-mal cytotoxicity, indicating that Lipofectamine 3000 could be a proper choice for transporting massive plasmid into SKOV3 cells.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2018(035)003【总页数】4页(P27-29,33)【关键词】Lipofectamine 3000;FuGENE HD;DNA-In CRISPR;pAdeasy-1-EGFP;SKOV3细胞;大片段质粒【作者】朱国念;倪银芸;吴思思【作者单位】四川大学华西医院公共实验技术中心,成都610041;四川大学华西医院公共实验技术中心,成都610041;四川大学华西医院公共实验技术中心,成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q28在基因治疗中，时常需要使用大质粒，用于传输大编码序列如全长肌营养不良蛋白基因[1]或同时转染含有多个基因的大质粒(如用于诱导多能干细胞重编程)[2]。

对于大基因的转染，病毒转染法通常不是最好的选择，因为它们可以携带的总DNA数量有限；此外，它们可能存在许多安全性问题，特别针对临床应用的限制。

目前基因治疗研究最多的是通过脂质体介导法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法及显微注射法等技术实现[3-4]，不同基因转染方法，其转染效率也具有一定的差别。

其中脂质体介导法具有安全、操作简便、对细胞毒性低、低免疫原性等特点而得到广泛的应用[5]。

然而，在体外脂质体转染效率会随着质粒大小的增加而下降，脂质体包裹外源DNA向细胞质扩散过程中强烈依赖于DNA的大小；同时通过脂质体转染在体内也观察到随着质粒的大小增加时，转染效率下降。

另一方面，尽管在阳离子脂质介导的转染中，与小质量分子相比，大质量的质粒在核递送过程中更易受损，已有研究使用等效质量或摩尔浓度的不同大小的构建体观察到这种效应，表明质粒的核递送可能受细胞内转运的速率的限制，小质粒通过快速转运通过细胞质来避免降解，而不是通过饱和细胞防御[6]。

卵巢癌细胞株SKOV3，是用于化学药物及重组载体对肿瘤细胞治疗效果评价的重要细胞系。

此细胞也经常用于基因治疗有关功能的研究，在基因敲除实验中细胞实验部分最常采用的是外源基因转染的方法来实现敲除，故采用SKOV3细胞株来研究转染试剂的效率，为以后基因治疗提供更多的基本思路[7-9]。

本研究分别用Lipofectamin3000、 FuGENE HD和DNA-In CRISPR 3种转染试剂转染带有绿色荧光蛋白的大质粒pAdeasy-1-EGFP(35 kb)质粒进入SKOV3细胞，以探究较适合转染大质量质粒的转染试剂。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系和质粒293T细胞、SKOV3细胞、pAdeasy-1-EGFP质粒，均由本实验室提供。

1.1.2 主要试剂DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司；FuGENE HD转染试剂购自Roche公司、DNA-In CRISPR转染试剂购自Amsbio公司；质粒提取试剂盒购自Omega公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自东仁化学。

1.2 方法1.2.1 质粒制备在大肠杆菌感受态细胞DH5α中转化pAdeasy-1-EGFP质粒，在培养平板中倒置培养过夜后挑出阳性克隆，在含有卡那霉素抗性的溶菌肉汤培养基(LB培养基)中进行扩大培养，按照质粒提取试剂盒中的产品说明书进行提取纯化，并测定浓度和纯度。

1.2.2 细胞转染荧光观察：将SKOV3细胞分别按3×104/孔接种于24孔板，待细胞融合至约60%融合度时转染pAdeasy-1-EGFP质粒，每孔转染1 μg质粒。

Lipofectamine 3000和DNA-In CRISPR分别以转染试剂(μL)∶质粒(μg)=2∶1的比例配制脂质体-质粒复合物；FuGENE HD则以3∶1的比例配制脂质体-质粒复合物，后续转染步骤分别按每种转染试剂的说明书进行转染操作，在37℃培养24 h后观察分析转染效率。

CCK8检测细胞增殖：将293T细胞和SKOV3细胞分别按1×104/孔接种于96孔板，待细胞融合至约60%融合度时转染pAdeasy-1-EGFP质粒，每孔转染质粒0.1 μg。

3种转染按比例配制脂质体-质粒复合物，后续步骤严格按照每种转染试剂的说明书进行操作。

37℃培养24 h后检测细胞增殖情况。

1.2.3 荧光显微镜采图在转染24 h后，更换新鲜的DMEM培养基，使用ZEISS倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号，使用显微镜自带ZEN软件对荧光信号进行采集与分析，以确定荧光细胞的比例。

1.2.4 细胞活性检测细胞转染24 h后，按照每孔培养基体积∶CCK-8 溶液体积=10∶1的比例加入10 μL的CCK8，在培养箱中继续孵育培养 2 h，在酶标仪450 nm 处测定各孔的吸光度值以此来计算细胞增殖情况。

1.2.5 统计学分析每组实验重复3次以上，所获得的数据均以统计学分析中平均值±标准差的形式来表示，不同转染试剂组间细胞活性的对比采用单因素方差分析，以 P<0.05 表示差异有统计学意义。

所有统计均在Graphpad Prism软件中完成分析处理。

2 结果2.1 293T和SKOV3细胞转染效率比较图1 DNA-In CRISPR转染293T细胞和SKOV3细胞后荧光图(5×)Fig 1 The fluorescence of 293T and SKOV3 cells transported by DNA-In CRISPR (5×) a、b：293T和SKOV3细胞转染荧光; c、d：293T和SKOV3细胞明场将DNA-In CRISPR(μL)和pAdeasy-1-EGFP质粒(μg)以2∶1的比例配制脂质体-质粒复合物，对293T细胞和SKOV3细胞进行转染，培养24 h后通过荧光显微镜观察荧光信号。

结果发现针对这两种细胞，SKOV3细胞转染效率约5%，293T 细胞转染效率不到1%(图1)。

因此可得，同种转染试剂针对不同细胞其转染效率也会有所不同；而对于SKOV3细胞，需要使用更为合适的转染试剂以此来提高其转染效率。

2.2 3种转染试剂转染SKOV3细胞的效率比较将Lipofectamine 3000、FuGENE HD、DNA-In CRISPR 3种转染试剂与pAdeasy-1-EGFP质粒以不同比例配制成脂质体-质粒复合物后对SKOV3细胞进行转染，作用24 h后用荧光显微镜观察荧光情况，图像结果表明Lipofectamine 3000(2∶1)的转染效率高于50%；而FuGENE HD(3∶1)的转染效率约20%；DNA-In CRISPR(2∶1)转染效率在5%左右(图2)。