第七组 从蛋清中提取溶菌酶并分离纯化的实验方案

分子生物学实验设计方案

蛋清溶菌酶的分离纯化·············

蛋清溶菌酶的分子量鉴定···········

组长：喻芳

组员：蒙秋萍安贵杰何玉叶刘飞

从蛋清中提取溶菌酶并分离纯化

【实验目的】

1. 掌握离子层析分离纯化溶菌酶的原理以及离子交换层析的操作方法

2. 理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理

3. 掌握电泳原理以及SDS－PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术

【实验原理】

溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。

活性中心为天冬氨酸

52和谷氨酸

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，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-

乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50O C，最适PH为6～7左右。在280nm 的消光系数[%1cm

1

A]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。

鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本文实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取并分离纯化。

溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离，再用DE-52纤维素离子交换色谱和葡聚糖G50凝胶层析分离纯化，最后用SDS-PAGE鉴定。

【材料与仪器】

鸡蛋3个 DE-52纤维素葡聚糖G50

0.5*7cm色谱柱、2.5*20cm色谱柱、烧杯(100ml,250mL，1000mL)、锥形瓶(100ml)、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒（100mL,250 mL，1000 mL）、10 mL 离心管、1.5mL Ep管、高速离心机、冰箱、SDS-PAGE电泳设备、电炉【试剂配制】

1. 40%甘油

2. 冰醋酸

3. 5mol/L NaOH

4. 20%磺基水杨酸溶液

5. TEMED溶液,4℃保存。

6. 10%过硫酸铵(AP)：称取过硫酸铵（NH4）2S2O8lg，溶于10mL蒸馏水中。（临用前配制）

7. 2×SDS上样缓冲液：0.1mol/L Tris-Hcl（pH6.8）、4％SDS、20％甘油、0. 2％溴酚蓝，4％β－巯基乙醇，4℃保存。

8. 30%丙烯酰胺贮存液：称取29.2g丙稀酰胺、0.8g N,N’-甲叉双丙稀酰胺，加少量蒸馏水溶解后定容至100mL。过滤，4℃保存。

9. 分离胶缓冲液（1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液）：取18.2g Tris，加少量蒸馏水溶解。用1mol/L盐酸调节pH至8.8（约48ml）后，定容至100mL。

10. 浓缩胶缓冲液（0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液）：取 6.0g Tris，加少量蒸馏水溶解。用1mol/L盐酸调节pH至6.8（约48mL）后，定容至100mL。

11. 4%浓缩胶（10mL）：0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 2.5mL,胶贮液 1.3mL，10%SDS 100ul，TEMED 10ul，10%AP 100ul，双蒸水6.1mL。

12. 12%分离胶（20mL）：1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 5mL,胶贮液8mL，10%SDS 200ul，TEMED 8ul，10%AP 200ul，双蒸水6.6mL。

13. pH8.3 Tris-Gly电泳缓冲液：Tris 6 g、glycine 28.8 g、SDS 1 g，加少量蒸馏水溶解，pH调至8.3，定容至1 L。

14. 考马斯亮蓝染色液：1.25g考马斯亮蓝R250、450mL甲醇：水（1：1）50mL冰醋酸。

15.脱色液：450mL甲醇：水（1：1）、50mL冰醋酸。

16. 0.02 mol/L PBS( pH8.0)：取5.3mL 0.2M NaH2PO4溶液，94.7mL 0.2M Na2HPO4溶液，加蒸馏水稀释至1000 mL，混匀

【实验步骤】

1.溶菌酶的粗提取（约两个半小时）

拿3个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，然后用两层纱布过滤，去除脐带和蛋壳。记录其体积V1

加入1.5倍体积的pH8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀

用冰醋酸调pH4.7左右，充分搅拌

3500rpm，离心20min

弃沉淀，转移上清至烧杯中

加入1倍体积的pH8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/L NaOH调pH8.0

滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V2

取0.5mL清液并加入等量甘油于1.5mL Ep管中，制备2管，-20℃备用

余下的清液分装在10mL离心管中 -20℃冻存备用。（样品S1）

2.溶菌酶的分离纯化

（1）DE-52初次纯化溶菌酶

①DE-52纤维素的处理

a. 用0.5mol/LHCl洗涤：称取5克DE-52纤维素置于250ml烧杯中，加入75ml0.5mol/LHCl溶液，搅拌混匀数分钟，静置半小时后，加水100ml，用玻璃棒搅拌，静置10分钟，倾去上层悬浮的细颗粒。重复加水、静置、倾去上层悬浮细颗粒等步骤2~3次，用蒸馏水洗至流出液PH≥4。

b. 用0.5mol/L NaOH洗涤：加入0.5mol/L NaOH溶液75ml，静置半小时，加蒸馏水100ml，搅拌后倾去上层液，用蒸馏水洗至流出液PH≤8。

②装柱

色谱柱垂直装好，加入缓冲液赶走柱中气泡；关紧出口，把准备好的DE-52纤维素悬浮液边搅拌边用滴管加入柱内，打开出口，让其沉降，柱床沉体积13cm 高，床面盖少量缓冲液，并投入一小圆形滤纸，以隔开凝胶床面，再用缓冲液平衡。

③加样、洗脱