构建融合蛋白提高重组葡萄糖异构酶的催化性能
GST融合蛋白构建、表达与纯化
GST表达融合蛋白载体pGEX-KG大小：5006bp，氨苄青霉素抗性（Amp r），IPTG诱导表达酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994GST分子量：构建pGEX-KG-YFG重组质粒1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG）Primer Premier 5.0软件，分析YFG含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG载体的多克隆位点有重合2、确定合适的双酶切位点NEB网站（）Double Digest Finder软件，查找最佳双酶切组合（下表）NEB双酶切图谱BamHI EcoRI NEBuffer EcoRI + BSA at 37°C. BamHI may exhibit star activity in this buffer.XbaI NEBuffer 3 + BSA at 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in thisbuffer, so additional units of enzyme and/or longerincubation time may be necessary.NcoI NEBuffer 3 + BSA at 37°C.SalI NEBuffer 3 + BSA at 37°CXhoI NEBuffer 3 + BSA at 37°C.SmaI XbaINEBuffer 4 + BSA at 25°C withSmaI, then add XbaI and raisetemperature to 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in thisbuffer, so additional units of enzyme and/or longerincubation time may be necessary.NcoINEBuffer 4 at 25°C with SmaI, thenadd NcoI and raise temperature to37°C.XhoINEBuffer 4 + BSA at 25°C withSmaI, then add XhoI and raisetemperature to 37°C.SacINEBuffer 4 + BSA at 25°C withSmaI, then add SacI and raisetemperature to 37°C.HindIIINEBuffer 4 at 25°C with SmaI, thenadd HindIII and raise temperature to37°C.At least one enzyme has < 100% activity in thisbuffer, so additional units of enzyme and/or longerincubation time may be necessary.EcoRI NcoI NEBuffer EcoRI at 37°C.3、设计PCR上、下游引物Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物酶切位点外最多含6个碱基3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾3’端至少保证有10个碱基完全配对得分（Rating）大于70[注意]上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA）4、引物合成及保存合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：******************，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存5、PCR扩增YFG模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb反应条件（1）预变性94°C 5 min（2）变性94°C 30 s（3）退火待定30 s（4）延伸72°C 待定（5）重复2-5 25-30个循环（6）补平缺口72°C 10 min（7）暂存10°C[注意]退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min循环数小于30，减少错配琼脂糖电泳检测PCR产物0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml）100V，30-45min拍照或者紫外灯下切胶回收6、构建pGEX-KG-YFG酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng转化铺平板：Amp r挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了）鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达（1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根）（2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min（4）42°C，90s（5）冰上放置2-3min（6）加入300μl LB（无抗生素）（相当于菌体10倍体积的LB），37°C，250rpm，1 h （7）4000rpm，2min，弃上清，其余混匀以后涂平板（Amp r），37°C，过夜（16 h）（8）挑单克隆菌落，5ml LB（Amp r），37°C，250rpm，过夜（16 h）（）稀释10倍、20倍、50倍测定OD600（）选择合适的稀释倍数，5ml菌液，37°C，250 rpm，1 h，测定OD600（7）取100μl菌液加入5ml LB（Amp r）（50倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）（8）取500μl菌液加入5ml LB（Amp r）（10倍稀释）（其余菌液4°C保存），测OD600 （9）37°C，250 rpm，2 h（OD600：0.6-0.8），测OD600（10）室温放置20 min（摇床降温，30°C）（11）取100μl作为诱导前对照，冰上放置（12）菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1 mM（13）30°C，250 rpm，2 -4h（可做时间梯度），测OD600（14）取100μl作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，加入50μl 1×SDS 上样缓冲液（15）取4ml菌液，12000rpm，离心2min，收集到2ml离心管中（16）加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体（17）超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度200-300W（冰浴）（18）超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4°C，12000rpm，离心5min（19）超声后上清：取25μl上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）（20）超声后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬，取25μl，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）（21）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min（22）8-10%SDS-PAGE，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀（23）考马斯亮蓝染色[注意]（1）菌液OD值小于1即可（2）诱导时间最好做一个梯度，2-6h（3）诱导温度适当摸索，24°C、30°C（4）IPTG浓度可做梯度，1mM（5）超声条件可视实际情况改变，只要使细菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠8、测序确认上海生工生物工程技术服务有限公司（Tel：81767529）测序引物：pGEX-3通用引物测序样品：过夜菌1ml；质粒（浓度大于50ng/μl，10μl）9、中提质粒（Promega）10、表达纯化GST融合蛋白（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21（DE3）pLysS（2）活化：取20μl菌液加入11ml LB（Amp r）（500倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）（3）取10ml菌液加入100ml LB（Amp r）（10倍稀释）（剩余菌液4°C保存）（4）37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8（OD600小于1.0即可）（5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置（6）加入IPTG，终浓度1 mM（7）30°C，250rpm，诱导适当时间（预实验确定）（8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液（9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞（10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中（无气泡）（11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W（冰浴）（12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min（13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入50μl 2×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）（14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液（或PBS）重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS 上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）（15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min（16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀（17）考马斯亮蓝染色（18）混匀glutathione sepharose beads（4B）（mixed slurry），取200μl加入15ml离心管中（2份）（19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清（20）加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟（或过夜）（横放）（21）4°C，3000rpm，离心3min（22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次（冰上）（23）10ml TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）洗涤2次（冰上）（24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油），混匀（25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE（26）-20°C保存beads11、GST-Pull-down（1）10cm培养皿中，未处理的细胞或者转染的细胞（3-5μg质粒转染10cm培养皿，Cos-7、293T或者其他细胞，转染24h）（2）加入1ml 细胞裂解缓冲液，细胞铲刮下细胞（冰上）（3）将裂解液收集到1.5ml离心管中，振荡30s，冰上放置5min，重复2-3次，充分裂解细胞（4）4°C，12000rpm，离心15min，收集上清（5）测定蛋白浓度，取1mg总蛋白做GST-Pull-down？（6）留30μl作为input对照（input与Pull-down蛋白量约为1/10）（7）其余溶液，加入20μl glutathione sepharose beads（PBS洗涤过），4°C，轻柔振荡20min（8）12000rpm，离心3min（9）收集上清，分为两份，一份加入1-15μg GST结合的beads，另一份加入等量GST-融合蛋白结合的beads，4°C，轻柔振荡60min（10）3000rpm，离心3min，回收上清（11）1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次（12）弃尽上清，加入25μl 2×SDS上样缓冲液（13）煮沸3min，12000rpm，离心3min（14）SDS-PAGE，上样顺序：细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白（x：LSB）（15）考马斯亮蓝染色或免疫印迹[附录]GST裂解缓冲液（前四个组分配好之后4°C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加）常用IP细胞裂解液cleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 μg immobilized GST or GST-32。
原核表达系统的工作原理
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
酶工程名词解释
酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。
锁钥学说（酶的专一性）：酶与底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的互补关系诱导契合学说：酶分子的构象与底物原来并非恰当吻合，只有当底物分子与酶分子相互碰撞时，可诱导底物的构象发生变化，使其与底物配合，然后才结合形成中间络合物，进而引起底物分子发生相应的化学变化。
酶：由生物体细胞合成的具有选择性催化功能的生物大分子( 包括蛋白质和核酸）单纯酶(simple enzyme)：仅由氨基酸残基构成的酶。
结合酶(全酶)(conjugated enzyme)：由蛋白部分(酶蛋白apoenzyme)和非蛋白部分(辅助因子cofactor)组成辅酶（coenzyme）：与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。
辅基（prosthetic group）：与酶结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。
酶的活性中心：酶蛋白上只有少数氨基酸残基参与酶对底物的结合和催化，这些相关氨基酸残基在空间上比较靠近，形成一个与酶显示活性直接有关的区域，称为酶的活性中心。
必需基团：酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化作用所必须，这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失，称为必需基团。
接触残基(contact residues)：和底物直接接触，参与底物的化学转变，是活性中心的重要组成部分。
辅助残基(auxiliary residues)：使酶与底物相互结合，辅助接触残基。
结构残基（structural residues）：维持蛋白酶形成一种有规则的空间构象非贡献残基（non-contributing residues）：不参与酶的催化功能，对酶活性的显示不起作用结合基团：与底物结合的部位，决定酶的专一性；催化基团：促使底物发生化学变化的部位，决定反应的性质。
结构域：蛋白质肽链中一段较独立的具有完整、致密立体结构的区域。
代谢工程改造微生物合成单萜芳香产品的研究进展
代谢工程改造微生物合成单萜芳香产品的研究进展摘要：单萜及其衍生物是重要的植物天然产物，且具有多种生物学功能。
该类物质在多个领域中均表现出较高的开发利用价值，目前已被作为优质香精香料广泛应用于食品、饮料、化妆品和医药工业中，市场需求日益增长。
从植物中提取这些单萜芳香产品存在着来源少、含量低和分离困难等缺点，很难满足市场需求。
因此，开发生产单萜芳香产品可再生的微生物资源来补充甚至代替原有的植物资源就具有重要的理论意义和应用价值。
近年来，研究人员利用代谢工程技术已经成功构建了合成单萜芳香产品的微生物细胞工厂，达到了利用微生物合成法生产该类工业产品的目的。
本文主要从菌株改造、发酵优化及产物分离等角度总结了相关产物合成的代谢工程实例，并分析了目前利用代谢工程改造微生物合成单萜芳香产品所面临的瓶颈问题及其可能的解决方法，旨在为构建异源、廉价、高效生产单萜芳香产品的微生物细胞工厂并最终实现其绿色制造提供参考。
关键词：代谢工程，单萜，单萜衍生物，微生物细胞工厂，底盘从代谢工程概念的首次提出到现在的30年左右的时间里，在分子生物学、基因组学、生物化学和基因工程等相关学科和技术的推动下，经过几代人的努力，目前代谢工程已经形成了一套比较完备的理论体系和技术方法。
现阶段，代谢工程技术的基本路线就是首先利用先进的生物理论和技术对细胞的代谢途径及调控网络进行分析并提出合理的设计策略，再结合基因重组技术对相关途径和网络进行修饰、改造、扩展或者引入，从而实现改变细胞特性或者提高特定代谢产物产量的目的。
近年来，越来越多的科研人员投身于利用代谢工程技术构建微生物细胞工厂的研究工作。
所谓的微生物细胞工厂如同一般意义上的工厂一样[1]，由微生物细胞作为制造产品的生产厂房，代谢通路担任生产线，培养基提供生产原料和动力来源，而细胞内复杂的反馈和调控机制则是生产管理系统，工厂内各个部门之间密切配合，最终目的是实现目标产品产量的最大化。
这其中最热门的研究就是利用代谢工程技术在不同微生物底盘中成功构建了包括单萜及其衍生物在内的多种植物天然产物的生物合成途径，如柠檬烯、紫苏醇、香叶醇、芳樟醇等。
酶的改造方法进展
pH稳定性： pH梯度
极端环境：高盐、低温、高浓毒物质
平板筛选方法
依据颜色变化筛选
大肠杆菌ß-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色）
反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚
海因酶筛选
脂肪酶筛选
平板筛选方法
依据透明圈大小筛选
淀粉酶的进化：淀粉平板培养基
豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基
• 海藻酸钠先加热配成溶液，取一定量碱性蛋白酶溶液和海 藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后用蠕动泵将混合液滴入2% 的CaCl2 中形成凝胶珠，放入4 ℃冰箱硬化4h，得到海藻
酸钠微球。
• 卡拉胶加热配成一定的浓度, 50℃ 水浴保温 , 加入乳糖酶 溶液，均匀搅拌后冷却，4℃ 冰箱中硬化，得到块状固定 化酶；
• 抗体的特性
1） 蛋白质特性
2） 能高选择配体，专一性与抗原结合 3） 种类达千万种
• 酶的特性
1） 大部分为蛋白质
2） 能高选择性结合底物，催化反应高效进行
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抗体酶催化的应用实例
重排反应
模拟结果：以椅式构象的氧杂双环化合物为反应的过渡态类似物，制
备了催化分支酸为预苯酸的抗体酶，比原反应速度快102-104倍，而且仅催
修饰后，生成3-硝基酪氨酸残基，使酶对带正电荷的底
物结合能力显著增强；
4）肽链有限水解修饰实例
胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
5）氨基酸置换修饰实例
Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶
活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去
对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等 底物水解的活性。 评价：化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且 要对酶分子逐个修饰，操作复杂，难以工业化生产；
2022-2023学年辽宁省六校协作体高二下学期期中生物试题
2022-2023学年辽宁省六校协作体高二下学期期中生物试题1.下列有关果酒果醋发酵条件的控制，下列叙述错误的是（）A．果酒发酵的最适温度要低于果醋发酵的最适温度B．发酵的装置可用洗洁精和无水乙醇进行清洗和消毒C．进行果酒发酵时，每隔12h左右需要拧松瓶盖排放CO 2D．酒精发酵液呈酸性，且酒精浓度较高，杂菌难以生存2.制作泡菜的过程中，会有亚硝酸盐产生（与杂菌有关），人体摄入过多亚硝酸盐，会发生中毒，甚至死亡。
某兴趣小组探究泡菜制作过程中不同浓度的食盐对亚硝酸盐产生的影响，结果如图。
下列相关叙述错误的是（）A．发酵早期，5％NaCl组内产生亚硝酸盐的微生物活性较强B．发酵中期，发酵液pH降低，抑制了其它微生物的生长C．该实验的无关变量有发酵温度、腌制方法和时间长短等D．制作过程中检测亚硝酸盐含量，为最佳取食时间提供依据3.在实验室进行微生物的培养过程中，无菌技术发挥了重要的作用。
下列关于无菌技术的说法，正确的是（）A．配制培养基、倒平板、接种都需要在酒精灯火焰旁进行B．配制好选择培养基后将其分装到培养皿中，再进行湿热灭菌C．煮沸消毒法中100℃煮沸5-6分钟可以杀死微生物细胞和所有芽孢、孢子D．紫外线照射前，适量喷洒石炭酸等消毒液，可加强对超净工作台的消毒效果4.水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。
聚乙烯醇（PVA）是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解后蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑。
下列相关叙述错误的是（）A．鉴别PVA分解菌的培养基中只需加入唯一碳源PVA、碘液、其他各种营养物质即可B．实验中还应设置加入完全培养液的对照组，对照组的菌落数明显多于选择培养基C．要测定PVA分解菌的数目，可在显微镜下用细菌计数板直接计数D．对PVA分解菌计数时，应选择菌落数为30—300的平板5.由于发酵工程生产条件温和、原料来源丰富、价格低廉等，在食品工业、医药工业、农牧业等许多领域得到了广泛的应用，下列有关发酵工程的描述，正确的是（）A．分离、提纯获得微生物细胞本身或其代谢产物是发酵工程的中心环节B．啤酒的工业化生产中，酵母菌的繁殖在主发酵阶段完成，大部分糖的分解和代谢物的生成在后发酵阶段完成C．将乙型肝炎病毒的抗原基因转入酵母菌，再通过发酵，可生产乙型肝炎疫苗D．可通过发酵工程从微生物细胞中提取单细胞蛋白，制成微生物饲料6.下列有关植物细胞工程技术及应用的叙述，正确的是（）A．植物组织培养时，诱导愈伤组织期间一般需要光照B．利用植物组织培养技术培育脱毒苗，获得抗病毒的新物种C．利用植物组织培养技术产生突变体，不需筛选即可获得具有优良性状新品种D．利用植物细胞培养技术获得紫草宁，实现了细胞产物的工厂化生产7.科学家将番茄（二倍体）和马铃薯（二倍体）细胞利用图示技术获得了“番茄—马铃薯”植株。
DNA的重组(考研分子)知识点梳理
DNA的重组（考研分子）知识点梳理1.D NA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称为遗传重组（genetic recombination）或基因重排（genetic rearrangement），重组产物为重组体DNA，DNA的重组广泛存在于各位生物中，真核生物多发生在减数分裂同源染色体之间的交换2.D NA重组能够迅速增加群体的遗传多样性，使有利的变异与有害的变异分开，通过优化组合积累有意义的遗传信息；为DNA的损伤或复制障碍提供修复机制；调控某些基因的表达或生物的发育过程3.D NA重组（recombination）●概念：指发生在DNA分子内或DNA分子之间的核苷酸序列的交换、重排和转移的现象，是已有遗传物质的重新组合过程，包括同源重组、位点特异性重组和转座重组，是基因变异和物种进化的遗传基础●作用：生物体利用重组产生新的基因或等位基因组合、病毒利用重组将自身DNA整合到宿主细胞DNA中；基因工程技术利用重组进行基因敲除和遗传作图、生物体利用重组进行重组修复●分类●同源重组（homologous recombination）●概念：又称为一般性重组（general recombination），它是由两条具有同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接而产生片段交换的过程，不依赖序列的特异性，只依赖序列的同源性，包括细菌的接合、转化和转导真核生物同源染色体之间的交换等●同源重组的类型●解释同源重组机制的模型●Holliday 模型●内容1)两个同源染色体DNA相互靠近，排列整齐2)两条链在对应的位置上各产生一个单链的断裂3)被切开的链相互入侵、交换、连接形成Holliday中间体4)通过分支迁移产生异源双链DNA5)Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组DNA，根据切开方向分为片段重组体（切开的链与原断裂的链为同一条，产生的重组体有一段异源双链区，异源双链区两侧来自同一亲本DNA链，左）和剪接重组体（切开的链不是原来断裂的链，重组体异源双链区两侧不是来自同一亲本DNA，右）●不足：Holliday模型能够较好地解释同源重组现象，但是两个DNA 分子对应链的相同位置发生断裂的可能性很小●单链断裂模型1)两个同源染色体中某一个DNA分子的一条链发生断裂产生3'末端，入侵另一个DNA分子的同源区的互补链并与之配对，●双链断裂模型1)在一个DNA分子中产生一个双链断裂，DNA外切酶在断裂处进行修剪，产生3'末端，3'末端入侵另一条DNA分子并与之配对，对应的链则被置换出来以原来断裂的链配对，经过修复合成和链的再连接形成两个交叉●细菌的基因转移与重组的机制●接合（conjugation）1)细菌的细胞相互接触时遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞的过程2)供体细胞被定义为雄性，受体细胞被定义为雌性，转移DNA的过程由接合质粒完成，能促使染色体DNA基因转移的接合质粒称为F因子，F因子中与基因转移有关的转移区约占整个染色体的三分之一，其中的tra基因编码的蛋白质是构成F性菌毛的亚基，F性菌毛接触受体细胞表面后接合过程被活化，tra S和traT基因编码表面排斥蛋白（防止与F⁺细菌接合），F⁺细菌与受体细胞靠近后，TraD蛋白（一种内膜蛋白）作为DNA的转移通道，Tra I在Tra Y的协助下结合到接合质粒的转移起点切开一条链并与5'端共价结合，Tra I也有解旋酶活性，5'端进入受体细胞内便开始合成互补链，因此受体细胞变为F⁺细胞，而供体中的单链也合成互补链3)F因子也能整合在大肠杆菌染色体DNA上，当F因子启动接合时，质粒基因中转移起点被切开，其前导链引导染色体DNA单链转移，至于转移DNA链长短取决于转移过程的时间，转移到受体中的DNA单链先互补配对成双链，然后与受体DNA发生重组，外源基因的插入需要在两端分别形成交叉连接，即发生两个位点的重组4)整合在染色体DNA中的F因子也可能被切下来，不精确切割使切下来的F因子常带有宿主的染色体基因，称为F'因子，F'细胞与F⁻细胞杂交，供体部分的染色体基因随F'因子进入受体细胞，无需整合就能表达（因为接合质粒上有转录起始点），实际上形成部分二聚体，此时受体细胞变为F'，该过程叫性导（sexduction）●遗传转化（genetic transformation）1)是指细菌品系由于吸收了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状改变的现象，具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞（competence cell），感受态是暂时的，与特定的生理状态有关2)感受态因子可以诱导与感受态有关的蛋白的表达，如自溶素能使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶暴露，当游离的DNA与DNA结合蛋白结合后，核酸酶使其一条链降解，另一条链被吸收进入细胞，并与感受态特异蛋白结合整合到染色体DNA中发生重组3)也有少数细菌可以吸收双链DNA4)用高浓度Ca²⁺处理大肠杆菌可以使其转化为感受态●转导（transduction）1)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程，包括普遍性转导和局限性转导2)普遍性转导：宿主细胞基因组任意一段DNA组装到成熟噬菌体颗粒内而被代入受体菌3)局限性转导：某些温和的噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主的染色体整合部分的DNA切割下来取代病毒DNA●细胞融合（cell fusion）1)由于细菌细胞质膜融合导致基因转移和重组，实验室内可以通过使用溶菌酶将去除细菌细胞壁的肽聚糖使之成为原生质体进而完成融合●与重组有关的酶1)RecA蛋白●此蛋白可以诱发SOS反应和促进DNA单链的同化（单链与同源DNA分子双链发生链的交换）从而使重组过程中DNA配对、形成Holliday中间体和分支移动等过程能够实现●机理：数千个RecA蛋白单体与DNA单链结合形成螺旋状纤丝，此复合物与双链DNA作用使其部分解旋，然后迅速扫描单链DNA的互补序列，一旦找到，互补区双链进一步解旋与单链DNA沿5'——→3'方向互补配对，直到交换终止（ATP提供能量）●该基因突变会导致双链断裂积累，无法形成正常的联会复合体●真核生物中RecA的类似物：酵母中的Rad51和Dmc1蛋白；人体中的BCRA1和BCRA2蛋白，若编码这俩蛋白的基因突变会导致乳腺癌2)RecBCD蛋白●多功能酶：依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性（内外切都有）、ATP依赖的解旋酶活性●DNA分子发生双链断裂后，RecBCD结合在游离端，使DNA双链解旋并降解，当其移动到χ 位点（5'-GCTGGTGG-3'），在其3'端4—6个核苷酸处切开，产生有3'端的DNA单链，之后结合有RecA和SSB的DNA单链入侵双链DNA形成D环结构，RecA协助寻找同源区，互补配对后RecA和SSB被释放3)Ruv A、Ruv B和Ruv C蛋白●Ruv A蛋白能够识别Holliday 连结体的交叉点并结合，使其变成四方平面构象，并帮助Ruv B蛋白六聚体在交叉点上游结合在DNA双链上，通过水解ATP使双链解旋，并使异源链螺旋化，最后Ruv C蛋白切开联结体（分支迁移就是为了找到ATTG序列，才能切开）●减数分裂时的同源重组●启动重组的机制不同：双链断裂模型，但重组仅出现在断裂的一侧，杂合DNA只出现在同一条染色单体上●特异位点重组（site-specific recombination）●只发生在DNA的特异位点之间，依赖于序列的特异性，对序列的同源性要求低●λ噬菌体与大肠杆菌的位点特异性重组●特征：基本步骤同同源重组（链的交换、形成Holliday中间体、分支迁移、拆分），但是不需要RecA参与，分支迁移距离较短，依赖于特定的蛋白质识别重组位点，催化重组反应。
酶的改造
Myc ds-DNA的富集
实例：天冬氨酸转氨酶的热稳定性的定向进化
研究内容及执行情况
高通量筛选方法的建立
生物信息学技术手段的建立 天冬氨酸转氨酶热稳定性的改造
高通量筛选方法的建立
基于酶联免疫分析方法，选用医用检测试剂盒作为
检测试剂，建立了快速高效的酶活性检测方法，结合 使用96孔酶标板，形成了酶的高通量筛选方法。
提高镁离子浓度（常规PCR时浓度为0.5-2.5mmol/L）； 添加一定浓度的锰离子；
易错PCR方法实例
1993年，Chen and Arnold在非水相DMF中，定 向进化枯草杆菌蛋白酶E活力获得成功，在60
％和85％的DMF中，活力分别提高256和131倍；
优点：操作简便，随机用于较小基因的定向进化
科学家在线形虫体内植入 绿色荧光蛋白质
绿荧光水母—通过体内绿色 荧光蛋白发光
绿色荧光蛋白的应用
分子标记：GFP标记的微管结构
绿色荧光蛋白的应用
(a)
(b)
(c)
（d）
(e)
分子标记： FISH分析菌株
（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d） Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M. trichosporium OB3b
4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者 虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行的
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现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.10
构建融合蛋白提高重组葡萄糖异构酶的催化性能
邓辉1,2,3，王广林1,2，陈乃东1,3，韦传宝1,3 （1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安 237012）（2.中科院云计算中心公共安全研究院，广东东莞 523808）（3.六安市蛋白质分离与纯化研究中心，安徽六安 2370123） 摘要：为研究Ⅱ型Xylose/Glucose的N端蛋白序列对I型Xylose/Glucose的作用，实验将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶（TTGIase）N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的Ⅰ型葡萄糖异构酶（TFGIase）的N端，构建了融合蛋白N-TFGIase。实验结果显示：在相同培养和诱导条件下，N-TFGIase，菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%，比酶活比TFGIase高出26%，最适温度比TFGIase高出5 ℃，75 ℃下的半衰期较TFGIase延长30%，最适pH较TFGIase降低1.0。序列分析表明：TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构，提高了融合蛋白的表达效率；其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0，利于融合蛋白的初始折叠和包装；其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍，减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。 关键词：融合蛋白；超嗜热菌；Ⅱ型木糖/葡萄糖异构酶N端序列；催化性能；序列分析 文章篇号：1673-9078(2016)10-52-59 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.10.009
Construction of a Fusion Protein to Improve the Catalytic Performance of
Recombinant Glucose Isomerase DENG Hui1,2,3, WANG Guang-lin1,2, CHEN Nai-dong1,3, WEI Chuan-bao1,3 (1.College of Biology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Liu’an 237012, China) (2.Institute of Public Safety, Cloud Computing Center Chinese Academy of Sciences, Dongguan 523808, China) (3.Lu'an Research Center of Protein Separation and Purification, Lu’an 2370123, China) Abstract: To study the effect of the N-terminal protein sequence of type II xylose/glucose on type I xylose/glucose, the N-terminal 31 amino acid sequence of type II glucose isomerase (GIase) from the hyperthermophilic bacterium, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (TTGIase) was fused to the N-terminus of the type I glucose isomerase from Thermobifida fusca (TFGIase), to construct the fusion protein N-TFGIase. The experimental results showed that under the same culture and induction conditions, total yield of N-TFGIase produced by the bacteria was approximately 40% higher than that of TFGIase. The specific enzyme activity of N-TFGIase was 26% higher than that of TFGIase and the optimum temperature of N-TFGIase was 5 ℃ higher than that of TFGIase. The half-life of N-TFGIase at 75 ℃ was extended by 30% compared to that of TFGIase, and the optimum pH of N-TFGIase was reduced by 1.0 compared to that of TFGIase. Sequence analysis showed that the mRNA secondary structure of the N-terminal sequence of TTGIase did not form a blocked cervical-loop structure, thereby improving the efficiency of expression of the fusion protein. The hydrophobicity indices of 31 amino acid residues of the N-terminal sequence were all less than zero, favoring the initial folding and packaging of the fusion protein. The proportion of acidic amino acid residues was approximately twice that of the basic amino acid residues of the N-terminal sequence, thereby reducing the impact of the acidic medium environment on the surface of the fusion protein molecules. Key words: fusion protein; hyperthermophilic bacteria; N-terminal sequence of class II xylose/glucose isomerase; catalytic performance; sequence analysis
52 收稿日期：2015-11-04 基金项目：国家863计划项目(2012AA021500)；国家自然科学基金项目（81274021）；国家自然科学基金项目（H2801）；皖西学院科研基金项目（WXZR201616） 作者简介：邓辉，男，博士，研究方向：蛋白质和酶工程 通讯作者：韦传宝，男，博士，教授，研究方向：蛋白质工程
木糖异构酶（Xylose isomerase，XIase，EC 5.3.1.5） 可以催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，在微生物体内的糖代谢过程中起着重要的作用；在体外亦能催化D-葡萄糖到D-果糖的异构化反应，所以又称为葡萄糖异构酶（Glucose isomerase，GIase）。葡萄糖异构酶具有极其重要的工业应用价值，和蛋白酶、淀粉酶等合现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.10 称为重要的工业用酶[1]，引起研究人员的关注并对其开展了较为广泛的研究。在基础研究方面，发现该酶的结构非常稳定，是研究蛋白质结构与功能关系的优良模型之一[2]。
53 密根据氨基酸序列同源性，GIase可分为两大类[1](图
1)，Ⅰ型GIase(约390个残基)主要来自于链霉菌属Streptomyces sp.、苏里游动放线菌A. missouriensis、小瓶菌属Ampullariella sp.、节杆菌属Arthrobacter sp.和栖热菌属Thermus sp.等菌种，属间序列同源性超过50%。Ⅱ型GIase（约440残基）主要来自大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和栖热袍菌属Thermotoga sp.等，属间序列同源性不超过30%。两者相比，最明显特征在于Ⅱ型GIase的N端比I型GIase的N端多出一个延长的区域，约50个氨基酸残基，在空间结构上表现为一段无规则卷曲。而关于这段序列的功能和作用尚无相关研究报道。
图1 两种类型GIase亚基的空间结构 Fig.1 Sp GIase )括号 Ther升TFGIase的生产性能，本文从ClassⅡ GIas1 材料和方法 1.1 菌株、质粒和试剂 因的重组质粒pMD18-T/ TFxy板，利用引物对F1和atial structure of the subunits of type II注：a为Ⅰ型GIase (1BXB_A)，b为Ⅱ型GIase (1A0C_A内编号为晶体结构代码，Ⅱ型GIase的N端序列标为红色。在本实验室前期工作中，一种来源于嗜热放线菌mobifida fusca的葡萄糖异构酶基因TFxylA在E. coli中成功克隆，该TFGIase为Ⅱ型GIase。实验对其进行了酶学性质和转化率的分析，该酶天然状态为四聚体结构，分子量为168 ku。以葡萄糖为底物该酶在70 ℃、pH 7.5条件下，Km和Kcat值分别为190 mmol/L
和35 s-1，能将浓度为45%的葡萄糖溶液中53%的葡
萄糖转化果糖，高的催化活力、高的转化率将使该酶成为改进葡萄糖异构化食品工业过程中潜力巨大的候选者[3]。
为了提e N端序列的作用和功能的研究角度出发，比对了8种不同种属产生的Ⅱ型GIase的N端序列，并从Ⅱ型GIase中，选择了一种超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricu GIase的N端
序列（MNKYFENVSK IKYEGPKSNN PYSFKFYNPE E）作为研究对象，把它融合到TFGIase的N端，以研究它对Ⅰ型Thermobifida fusca GIase（TFGIase）的影响和作用。