Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础_藏雨轩
沉默钙激活氯通道ANO1促进人前列腺癌PC-3细胞的凋亡
沉默钙激活氯通道ANO1促进人前列腺癌PC-3细胞的凋亡宋艳;关立照;王克威【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2015(31)B11【摘要】目的探讨沉默钙激活氯通道（anoctamin1,ANO1）对人前列腺癌PC-3细胞凋亡的影响及其分子机制.方法采用siRNA沉默ANO1在PC-3细胞的表达;采用ELISA、流式细胞仪检测细胞凋亡;采用Apo-ONEHomogeneous Caspase-3/7Assay检测Caspase活性;采用基因表达谱分析检测沉默ANO1表达后PC-3细胞内基因变化,以及Real-timePCR和Westernblot验证.将全长ANO1基因（来源于NCBI）与pIRES2-EGFP融合,构建ANO1-IRES2表达载体,获得稳定表达ANO1的RWPE-1细胞系.结果ANO1在人前列腺癌PC-3细胞中呈高表达,沉默ANO1可诱导PC-3细胞凋亡,并增加肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF-α）表达和Caspase-3/7活性.TNF-α抑制剂来那度胺（lenalidomide）20nmol·L^-1可逆转沉默ANO1诱导的细胞凋亡.同时,ANO1在人正常前列腺细胞RWPE-1中呈低表达,过表达ANO1可降低RWPE-1细胞凋亡,同时降低TNF-α表达和Caspase-3/7活性.总之,ANO1表达与TNF-α呈负相关.结论沉默ANO1表达可诱导PC-3细胞凋亡,其机制可能与激活TNF-α介导的信号转导通路相关.【总页数】1页(P9-9)【关键词】钙激活氯通道;ANO1-TMEM16A;前列腺癌;细胞凋亡;肿瘤坏死因子TNF-α【作者】宋艳;关立照;王克威【作者单位】北京大学药学院分子与细胞药理学系,北京100191【正文语种】中文【中图分类】R730.1【相关文献】1.钙激活氯通道 ANO1在小鼠心肌细胞的表达及其功能鉴定 [J], 侯毅鞠;许会静;张雲乔;扈昕虹;郝峰2.ANO1参与了ATP对成纤维细胞上钙激活氯通道的激活及意义 [J], 王天;李良昌;郑海锋3.钙激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达及其功能鉴定 [J], 张雲乔;王胜;刘艳杰;崔爽;曲适;王鑫鑫;龙啸;方芳;郝峰4.钙激活氯通道蛋白ANO1在心肌成纤维细胞分化过程中的表达及其钙激活氯通道电生理特性变化 [J], 田香勤;谭朝阳;李娜娜;常玉巧;张爱梅;周颖;马克涛;司军强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人卫版药理学第8版21钙拮抗药
【分类】
1. 电压依赖性钾通道: 1)延迟整流钾通道(KV):Ik〔IKr IKs〕→AP 3相 2)瞬时外向钾通道(KA):IA 或Ito →AP１相 3)起搏电流(If) →心脏传导系统起搏电流之一
2. 钙依赖性钾通道(KCa): IK(Ca) →血管 SM 松弛 3. 内向整流钾通道(KIR) : IK1 →维持 4相 RP 4. ATP敏感钾通道(KATP) : IK(ATP) →调节机体C功
第21章 离子通道及 钙通道阻滞药
Chapter 21 Ion Channel and Calcium Channel Blocking Agents
【目的要求】
1．掌握钙通道阻滞药的药理作用与临床 应用； 2．熟悉作用于钠、钾通道的药物应用； 熟悉离子通道的特性和分类，离子通道的 生理功能，通道分子构造及门控机制； 3．了解离子通道概念及研究简史；了解 钙通道阻滞药的分类和作用机制。
4.抗充血性心衰: 尼可地尔〔↓心脏负荷，↑CO〕 5.平喘,镇咳: 克罗卡林, 吡那地尔
机制：对抗PGE、5-HT等引起的支气管痉挛、 阿片样镇咳效应
第3节 钙通道阻滞药
钙通道阻滞药(calcium channel blockers， CCBs) 是一类选择性阻滞钙通道,抑制胞外Ca2+ 内流，降低胞内Ca2+浓度的药物,又称钙拮抗药 (calcium antagonists)。
电压依赖性钙通道(VDCC):
〔2〕T-型(transient type): 激活电压低，失活速度快。 分布于全身细胞，参与心脏自律性调节、SM收
缩、N 放电、激素分泌等。 与多种疾病有关，如心律失常、心肌肥厚/纤
维化，高BP、癫痫、精神病等。
电压依赖性钙通道(VDCC):
心肌细胞 离子运输
心肌细胞离子运输
心肌细胞在心脏收缩和舒张的过程中，离子运输是非常重要的。
下面是心肌细胞中主要的离子运输过程：
钠离子（Na+）：心肌细胞内外浓度差异导致钠离子会从细胞外部向内部扩散，这个过程需要依赖Na+/K+泵和钠离子通道。
在心肌细胞的肌动蛋白激活和收缩期，钠离子通道会打开，使钠离子快速进入心肌细胞，引起细胞膜电位的快速上升。
钾离子（K+）：心肌细胞中的钾离子主要是通过K+离子通道和Na+/K+泵进行运输。
在心肌细胞的舒张期，钾离子通道会打开，使钾离子快速从心肌细胞内部流出，引起细胞膜电位的快速下降。
钙离子（Ca2+）：钙离子在心肌细胞中是一个重要的信号分子，通过Ca2+通道和Ca2+-ATP 酶进行运输。
在心肌细胞收缩期，钙离子通道会打开，使钙离子进入心肌细胞，与肌球蛋白结合，促进心肌细胞的收缩。
氯离子（Cl-）：心肌细胞中的氯离子主要通过Cl-通道进行运输。
在心肌细胞的舒张期，氯离子通道会打开，使氯离子快速进入心肌细胞，帮助细胞膜电位的下降和肌肉的松弛。
总之，心肌细胞中的离子运输对于心脏的正常收缩和舒张起着至关重要的作用，通过细胞膜上的各种离子通道和运输蛋白的作用，使得心肌细胞内部和外部的离子浓度得以平衡，实现心肌细胞的正常功能。
生物小综述钙离子第二信使-
Ca2+在信号传导中对植物生理的影响一、摘要本文简要分析Ca2+在信号传导中作为第二信使配合钙调蛋白和钙依赖型蛋白激酶的机制原理，并概述其对植物生长生理的影响。
二、关键词：Ca2+钙调素 CDPK 第二信使三、引言我们知道，矿质元素对植物的生长发育和生理过程起着重要作用，Ca2+就是其中最为重要的离子之一。
Ca2+既是植物细胞壁的重要组成部分，大部分Ca2+在细胞壁中与果胶酸形成果胶酸钙，起支持和加固作用；Ca2+对维持膜结构的稳定性也有一定作用；同时，Ca2+作为第二信使配合钙调蛋白和CDPK在植物生理的信号传导过程中具有重要作用。
四、正文1、钙稳态在静息态的胞质中Ca2+浓度≤0.1μmol/L，而通常在细胞壁、ER、液泡、线粒体中的浓度会高2~5个数量级。
细胞壁是植物细胞的最大钙库[1]。
细胞中各处的钙离子浓度梯度在未受刺激时是保持相对稳定的，当受到刺激时，由于胞外Ca2+浓度高与胞内，此平衡就会被打破。
信号分子与受体结合通常引起跨膜的离子流动，从而引起膜电位的改变。
在质膜上，存在Ca2+通道，类似于水通道，引起Ca2+的内流；同时存在Ca2+泵，是Ca2+外流的通道。
在胞内钙库如液泡、ER等结构的膜上也存在相应的结构，其上的Ca2+通道是从钙库流向胞质的通道，Ca2+泵、Ca2+/nH+反向运输体是Ca2+从胞质流向钙库的通道。
因此细胞质中的游离Ca2+的浓度主要受质膜和内膜系统上的Ca2+通道和Ca2+泵的调节。
任何一种外界刺激或激素所引起的细胞反应通过Ca2+作为第二信使传递的直接证据是细胞质中是否有游离Ca2+的浓度变化。
2、Ca2+的作用方式有两种：第一种是游离Ca2+的浓度直接或间接影响植物的生理过程；第二种是胞质里的Ca2+与钙结合蛋白，如钙调蛋白CaM（也叫钙调素）、钙依赖型蛋白激酶（CDPK）结合而起作用。
3、钙调素3.1 钙调素( Calmodulin, CaM)是一种分布最广，功能最重要的钙依赖性调节蛋白。
γ-氨基丁酸受体α-2亚基
γ-氨基丁酸受体α-2亚基γ-氨基丁酸受体α-2亚基是一种神经递质受体亚基，它在神经系统中起着重要的调节作用。
本文将从不同角度介绍γ-氨基丁酸受体α-2亚基的结构、功能及其在疾病治疗中的应用。
γ-氨基丁酸受体α-2亚基是一种膜蛋白，它主要存在于神经元细胞膜上。
该亚基是γ-氨基丁酸受体的一部分，γ-氨基丁酸受体是一种离子通道受体，它能够调节神经元之间的信息传递。
γ-氨基丁酸受体由多个亚基组成，其中α-2亚基是其中的一种。
γ-氨基丁酸受体α-2亚基具有多种功能。
首先，它能够与其他亚基结合形成成熟的γ-氨基丁酸受体。
当γ-氨基丁酸受体结合了γ-氨基丁酸（GABA）这一神经递质时，受体通道会打开，离子（如氯离子）会进入神经元，从而抑制神经元的兴奋性。
这一过程被称为抑制性神经递质的作用。
γ-氨基丁酸受体α-2亚基还能够调节其他信号通路。
研究发现，它能够通过激活蛋白激酶C（PKC）信号通路来影响神经元的功能。
PKC是一种重要的细胞信号传导分子，在神经系统中参与了许多生理过程，如学习记忆、情绪调节等。
因此，γ-氨基丁酸受体α-2亚基通过调节PKC信号通路，对神经系统的功能发挥着重要作用。
除了在正常生理过程中的调节作用外，γ-氨基丁酸受体α-2亚基还在一些疾病的治疗中发挥着重要的作用。
例如，一些研究表明，通过调节γ-氨基丁酸受体α-2亚基的活性，可以改善焦虑和抑郁症状。
这是因为γ-氨基丁酸受体α-2亚基在中枢神经系统中的表达与情绪调节密切相关。
因此，通过调节该亚基的功能，可以对抗焦虑和抑郁等情绪障碍。
γ-氨基丁酸受体α-2亚基在镇痛和麻醉中也起到重要的作用。
一些镇痛和麻醉药物能够通过与γ-氨基丁酸受体α-2亚基结合来发挥其作用。
这些药物通过抑制神经元的兴奋性，从而达到镇痛和麻醉的效果。
因此，了解γ-氨基丁酸受体α-2亚基的结构和功能，对于开发新的镇痛和麻醉药物具有重要的指导意义。
γ-氨基丁酸受体α-2亚基作为γ-氨基丁酸受体的一部分，在神经系统中起着重要的调节作用。
钙通道阻滞剂
钙通道阻滞剂展开全文钙通道阻滞剂钙通道阻滞药(calcium channel blockers)又称钙拮抗药(calcium antagonists)，是一类能选择性地阻滞Ca2+经电压依赖性钙通道流入细胞内，降低细胞内Ca2+浓度的药物。
临床上常用的钙通道阻滞药主要包括苯烷胺类(如维拉帕米verapamil等)、二氢吡啶类(如硝苯地平nifedipine等)和地尔硫卓类(如地尔硫卓diltiazem等)。
维拉帕米是最早发现的钙通道阻滞药。
1967年德国Fleckenstein等发现维拉帕米对心脏的作用与溶液中去掉Ca2+后作用相似，能降低心脏的收缩性，而不影响膜电位的变化和幅度，故称之为钙拮抗药。
自此大量的钙通道阻滞药便开始应用于临床。
一、细胞内Ca2+的作用与来源在体内Ca2+广泛参与组织细胞的生物反应，总结一下主要有以下几个方面：①肌肉（包括骨骼肌、心肌、各种平滑肌）的收缩。
②自律性细胞的自律性动作电位的形成。
③各种腺体的分泌。
④血小板的聚集、释放、收缩、胞排。
⑤肥大细胞的释放反应（脱颗粒）；多型核白细胞的运动、溶酶体酶的释放。
⑥神经递质的释放。
⑦大多组织在受损伤时，细胞内Ca2+增加，这种状态叫做Ca2+超载或Ca2+超负荷，Ca2+超负荷进一步加重细胞的损伤。
许多组织细胞要产生生物反应需要胞浆内的游离Ca2+浓度升高到一定水平，由于这些钙离子可使细胞激动，故又称激动钙(activator calcium)。
细胞静息时，细胞浆内游离Ca2+ 的浓度小于１μmol／L，细胞外液约为1.5mmol／L。
激动钙的来源主要有三：①经电位依赖性慢通道(potential dependent calcium channel, PDC)跨膜内流；②经受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium channel, ROC)内流；③从细胞内贮存或结合部位释放。
此三种来源常相互影响。
钙通道阻滞剂
• • • • e. 血压越高，降压作用越强。 f.使脑卒中的发生率下降。 g.可增加尿酸的排出。 h.伴有糖尿病及冠心病并发症的高血压患者以及对其他抗 高血压药物禁忌的患者
四、钙通道阻滞剂的临床应用
2、抗心绞痛 • 变异型心绞痛 • 劳累型心绞痛
四、钙通道阻滞剂的临床应用
3、抗心律失常 • 阵发性室上性心动过速 • 冠状动脉痉挛所致的室性心律失常
注射剂 CYP 3A4 注射剂 CYP 3A4 片剂 CYP 3A4
注射剂 CYP 3A4
维拉帕米
20
90
4~11
注射剂的钙通道阻滞剂
作用部位 作用特点 临床应用 不良反应
头痛、面红、心悸、踝 部血管性水肿、眩晕、 恶心、呕吐、乏力、精 神不振 与硝苯地平相似，但发 生率较低 与硝苯地平相似 与硝苯地平相似，但发 生率较低 与硝苯地平相似，但发 生率较低 对心脏无明显作用，降压 外周血管（尤 硝苯地平 其是冠脉） 作用强而迅速，但不稳定， 高血压、心绞痛 控释剂相对较好。 作用慢而稳定，维持时间 高血压、心绞痛 氨氯地平 外周血管（尤 其是冠脉） 长，副作用少。
硝苯地平 氨氯地平
45~75 60~65
90 98 98 95 97 99 80
4~11 36~50 50 2~9 8 11~16 5
控释剂 CYP 3A4 片剂 片剂 CYP 3A4 CYP 3A4
肝 肝 肝 肝 肝 肝、肠 肝
肾 肾 肾 肾、胆 肾 肾 肾、胆
左旋氨氯 60~65 地平
尼莫地平 尼卡地平 非洛地平 地尔硫卓 13 35 20 40
苯烷胺类 受体主要包括ⅣS6的膜内侧末端即
相连的胞内氨基酸残端
二、钙通道阻滞剂的作用机制
细胞内钙离子动态调控分子机制研究
细胞内钙离子动态调控分子机制研究细胞内钙离子（Ca2+）是细胞信号传递中起着重要作用的离子，它参与着诸如细胞分裂、细胞凋亡、细胞增殖、神经递质释放等重要的细胞生物学过程。
而细胞内的Ca2+浓度则是通过一系列复杂的调控机制来维护的。
本文将谈论细胞内钙离子的动态调控分子机制。
一、细胞内钙离子调控通路当刺激因素到达细胞时，它会激活特定的受体在细胞膜上进行识别，而这些受体会使膜内钙离子通道开启，使得细胞内的钙离子浓度快速升高。
此外，细胞内还存在一种称为IP3（inositol 1,4,5-trisphosphate）的次级信使分子，当它与其受体结合时，就会导致内质网中的钙离子释放到细胞浆中，从而导致钙离子浓度增加。
细胞还有一些细胞质钙离子传输通路，它们可以作为细胞内钙离子浓度调控过程中起着很重要的角色。
细胞内的这些通道包括：可控型钙离子通道和非电压活化型钙离子通道。
这些通道都有助于维持细胞内钙离子平衡。
细胞内钙离子的动态变化是细胞生物学中的一个重要的研究领域，也是一项可持续发展和不断进化的研究领域。
二、钙离子内耗作用钙离子内耗（calcium-buffering）是细胞中用于维持细胞内钙离子浓度的一种细胞防御机制。
这些钙离子绑定蛋白是一些蓝色钙离子蛋白，它们可以在细胞中迅速和大量吸收钙离子。
此外，细胞内还存在其他形式的钙离子内耗机制：细胞质酸性水解酶、钙离子(Ca2+)离子负载蛋白和小分子钙离子结合蛋白等。
这些钙离子绑定蛋白都有着不同的结构和功效，它们起着减缓细胞内钙离子浓度骤升的作用。
三、钙离子通道类型调控的分子机制细胞内的钙离子通道分为多种类型，包括：电压门控型、非电压门控型、钙激活型等。
每种类型的钙离子通道的调控机制千姿百态，不同的调控机制有助于维持不同的细胞功能。
例如，在神经元中，钙离子波动对神经网络活动起着重要作用，这是通过调节电压门控型的钙离子通道来实现的。
在心肌细胞中，则是通过调节钙激活型离子通道来维持其正常的收缩和舒张。
钙通道阻滞剂
苯磺酸氨氯地平Amlodipine besylate*
*
(±) -2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-1, 4-二氢 - 6-甲基-3, 5-吡啶二甲酸-3-乙酯-5-甲酯苯磺酸盐
24
第二节 钙通道阻滞剂
氨氯地平的特点
络活喜 生物利用度近100%，其吸收不受食物影响，
血药浓度稳定。
44
第三节 钠、钾通道阻滞剂
硫酸奎尼丁
金鸡纳树
其中含量最多且在医
药上最重要的是奎宁，
其次是辛可尼、辛可
尼定、奎尼丁等
45
第三节 钠、钾通道阻滞剂
硫酸奎尼丁
奎核碱环的叔氮原子碱性较强，可制成各种盐类
应用(硫酸盐、葡萄糖酸盐、聚半乳糖醛酸盐)
46
第三节 钠、钾通道阻滞剂
绿奎宁反应—Thalleioqin反应
5
第二节 钙通道阻滞剂
离子通道病
已经发现的钙通道病有家族性偏瘫型偏
头痛、低钾型周期性瘫痪、共济失调、肌无
力综合征等。
Ca2+通道对Ca2+、Ba2+都有高通透性， 但Ni2+、Cd2+、Co2+、Mn2+等离子能有效地
阻断Ca2+通道。
6
第二节 钙通道阻滞剂
钙通道的种类
根据调控通道开闭的因素，分为以下五类： 电压依赖式钙通道
57
第三节 钠、钾通道阻滞剂
普鲁卡因胺的代谢
普鲁卡因胺体内代谢主要发生在肝脏 产物为对氨基苯甲酸和N-乙酰基转移酶催化生成N-乙 酰基普鲁卡因胺—III类抗心律失常药物
50
第三节 钠、钾通道阻滞剂
对某些奎尼丁无效的病 例亦有效，副作用小， 故认为可以代替奎尼丁 和普鲁卡因胺
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2014年11月第34卷第11期基础医学与临床Basic＆ClinicalMedicineNovember2014Vol．34No．11
收稿日期：2014-02-12修回日期：2014-08-25基金项目：国家自然科学基金（81202031）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2013-351）；2013
年吉林省大学生创
新创业训练计划（856号）；吉林医药学院大学生科研项目［吉医学科字（2012）第12号］*通信作者（correspondingauthor）：haof863@126．com
文章编号：1001-6325（2014）11-1477-05研究论文Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础
藏雨轩1，方芳2，朱杭飞2，向国艳1，张雲乔1，李瑷彤1，郝峰1*（吉林医药学院1.生物化学检验教研室；2.免疫学教研室，吉林吉林132013）
摘要：目的探讨Ano2是否为钙激活氯离子通道的分子基础。方法用ＲT-PCＲ技术扩增Ano2编码基因，将Ano2
连接到真核表达载体pEGFP-N3；通过脂质体介导将Ano2转染至FＲT细胞，抗生素筛选获得稳定表达Ano2的细胞系；倒置荧光显微镜下观察Ano2在FＲT细胞中的表达和分布，Westernblot检测Ano2的表达；全细胞膜片钳技术研究Ano2的电生理学特性。结果成功构建pEGFP-Ano2真核表达载体；Ano2表达在FＲT细胞膜上；Ano2电流呈Ca2+、时间和电压依赖性，电流和电压关系呈外向整流。结论Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础。
关键词：Ano2；FＲT细胞；转染；钙激活氯离子通道
中图分类号：Q424文献标志码：A
Ano2isthemolecularidentityofcalcium-activatedchloridechannels
ZANGYu-xuan1，FANGFang2，ZHUHang-fei2，XIANGGuo-yan1，ZHANGYun-qiao1，
LIAi-tong1，HAOFeng1*（1.Dept．ofBiochemistryLaboratory；2.Dept．ofImmunology，JilinMedicalCollege，Jilin132013，China）
Abstract：ObjectiveToinvestigatethatwhetherAno2isthemolecularidentityofcalcium-activatedchloridechannels．MethodsThefulllengthcodingsequenceofAno2wasamplifiedbyＲT-PCＲ，Ano2andeukaryoticex-
pressionvectorpEGFP-N3wereligated；ThenrecombinantplasmidsweretransfectedintoFＲTcellsusingliposome，andthestabletransfectionFＲTcellswereselectedwithantibiotic；theexpressionandlocationofAno2wasob-servedbytheinvertedfluorescencemicroscopeanditsexpressionwasdetectedbyWesternblot；theelectrophysio-logicalpropertiesofAno2wereresearchedbywhole-cellpatch-clamptechnique．ＲesultspEGFP-Ano2wassuc-
cessfullyconstructed，FＲTcellmembraneexpressedAno2；theelectrophysiologicalpropertiesofAno2wereCa2+-，
time-andvoltage-dependent，andanoutward-rectifyingI/Vrelationshipwasobserved．ConclusionsAno2isthe
molecularidentityofcalcium-activatedchloridechannels．Keywords：Ano2；FＲTcells；transfection；calcium-activatedchloridechannels
钙激活氯离子通道（calcium-activatedchloridechannels，CaCCs）是一类在内皮细胞、平滑肌细胞和神经元等细胞广泛表达的阴离子通道，在跨上皮液体转运、嗅觉信号传导和平滑肌收缩等多种生理过程中扮演重要角色［1-2］，同时CaCCs也是治疗高血压、腹泻和
某些特定肿瘤等疾病潜在的药物靶点［3］。跨膜蛋白16
家族（transmembraneprotein16）共有10个成员，目前已证实Ano1（anoctamin1）是CaCCs的分子基础［4-5］，但基础医学与临床Basic＆ClinicalMedicine2014.34（11）对其他成员的作用还不十分清楚。本实验探讨Ano2（anoctamin2）是否是CaCCs的分子基础。
1材料与方法
1.1材料
限制性内切酶、T4连接酶和Taq酶（Takara公
司）；引物合成和测序（上海生工公司）；ＲT-PCＲ试
剂盒和Trizol（Invitrogen公司）；DNA凝胶回收试剂盒（Qiagen公司）；FＲT细胞（大连医科大学麻彤辉
教授馈赠）；兔源增强型绿色荧光蛋白（EGFP）抗体和羊抗兔二抗（中杉金桥公司）；F-12基本培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氯化铯（CsCl）、N-甲基-D葡萄糖胺（NMDG）和尼氟灭酸（niflumicacid，NFA）（Sigma公司）；胎牛血清（四季青公司）。1.2方法
1.2.1引物设计与合成：NCBI查询小鼠Ano2基因
（NM_153589）序列，设计位于开放读码框架两端的
引物，去除下游引物终止密码子后加入保护碱基和相应酶切位点EcoＲⅠ（GAATTC）和KpnⅠ（GGTACC）。上游引物：5'-CGAATTCCGTCTGAGCCGCATGCACTTT-3'；下游引物：5'-GCGGTACCTACATTGGTGTGCTGGGACC-3'。1.2.2ＲT-PCＲ扩增Ano2基因：提取小鼠视网膜总
ＲNA，仅转录为cDNA，以此为模板进行PCＲ反应，94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃3.5min，30个循环；72℃，10min，PCＲ产物琼脂糖
凝胶电泳后，切胶回收阳性片段。1.2.3pEGFP-Ano2的构建、转化与鉴定：EcoＲⅠ和
KpnⅠ双酶切Ano2与pEGFP-N3后，16℃连接过夜。将重组质粒转化入感受态DH5α，次日挑取阳性克隆，摇菌扩增，12h后提取质粒，酶切正确后测序。1.2.4稳定表达pEGFP-Ano2细胞系的建立：将长
势良好的FＲT细胞铺6孔板，置于37℃、5%CO2
培养箱培养。待第2天细胞汇合度达80%～90%，
将0.5μg质粒分別与1、1.5、2和2.5μL脂质体Li-pofectamine2000，混合进行转染，倒置荧光显微镜观
察转染pEGFP-Ano2在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞（Fisherratthyroid，FＲT）中Ano2的表达情况，选取转染效率高的质粒和脂质体比例进行后续实验。36h后将转染的FＲT细胞消化，按照1∶5∶10的比例传代到3个10cm培养板中，并加入含有
1000ng/mL的G418的完全培养液培养，挑取纯度
和表达量均较高的克隆到96孔板继续培养，待细胞汇合度达60%后扩大培养。1.2.5Westernblot检测pEGFP-Ano2的表达：转染
后36h，消化收集细胞并超声裂解，将定量的蛋白样品上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，180mA2h电转移至NC膜，脱脂奶室温封闭2h，然后加EGFP抗体、内参β-actin抗体和羊抗兔二抗摇晃孵育，TBST洗膜3次，ECL（A和B显色液等体积混合）化学发光试剂显影，放入凝胶成像系统中拍照，用Qualityone软件分析灰度值。实验数据以均值±标准差
（x±s）表示，应用SPSS13.0软件进行统计分析，组
间比较采用t检验。1.2.6全细胞膜片钳技术记录Ano2的电流：将转
染pEGFP-Ano2的FＲT细胞消化置于倒置荧光显微镜载物台，电极给予负压吸引并击破细胞膜，维持GΩ高阻抗封接，形成whole-cellpatch。初始钳制电压为0mV，施加从－100mV跃阶到+100mV电压（每
20mV一个step），各记录750ms电流变化，750ms后
电压变为－60mV，继续记录200ms，CaCCs的抑制剂NFA作为对照。配制600nmol/LCa2+溶液和
0nmol/LCa
2+
溶液，配方详见参考文献［6］。
2结果
2.1重组pEGFP-Ano2
真核表达载体双酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳结果约在4700、2700、7400、7400和4000bp处有5条清晰带，与预期结果一致（图1）。
1.ＲestrictionenzymeofrecombinantplasmidpEGFP-Ano2byEcoＲⅠ/KpnⅠ；2.EcoＲⅠsingleenzyme；3.KpnⅠsingleenzyme；4.pEGFP-Ano2recombinanteukaryoticexpressionplasmid；5.DL5000DNAmarker图1重组质粒电泳图Fig1Electrophoregramofrecombinantplasmid
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