高效液相色谱操作步骤ppt课件
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+ 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O<甲醇<乙腈<乙醇 <丙醇<异丙醇<四氢呋喃
+ 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇
叫展开。
5
色谱过程的本质是待分离物质分子在固 定相和流动相之间分配平衡的过程,不同 的物质在两相之间的分配会不同,这使其 随流动相运动速度各不相同,随着流动相 的运动,混合物中的不同组分在固定相上 相互分离。
不同组分在色谱分离过程中分离情况取 决于各组分在两相间的分配系数、吸附能 力、亲和力等的差异。
+ 分离效率高 若用塔板理论数来表示色谱柱的效率,每米柱长可达几 千至几十万的塔板数,特别适用于极复杂混合物的分离, 且通常收率、产率、和纯度都较高。
+ 操作模式多样 可通过选择不同的操作模式,以适应不同样品的分离。
+ 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
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+ 关于色谱分离方法的研究始于1901年,俄国植物 学家 Tswett(茨维特)在研究植物叶子的组成 时,用碳酸钙填充竖立的玻璃管,以石油醚洗脱 植物色素的提取液,经过一段时间洗脱之后,植 物色素在碳酸钙柱中实现分离,由一条色带分散 成三种颜色的6个色带。
+ 两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现 象及其在生化分析上的应用”,提出了应用吸附 原理分离植物色素的新方法,在这一方法中把玻 璃管叫做“色谱柱”,碳酸钙叫做“固定相”, 石油醚叫做 “流动相”。三年后,他将这种方 法命名为色谱法(Chromatography)。
吸附规律 阳离子交换树脂—分离碱性成分 阴离子交换树脂—分离酸性成分
13
大孔吸附树脂
吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体,二乙烯苯 为交联剂(非极性) 吸附力:范德华力或氢键 工艺流程:树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的 解吸→树脂的清洗、再生。
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原理:被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同。
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化学键合相
利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键 合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。 种类 非极性键合相:
如键合C18、C8、苯基等,其中十八烷(ODS或 C18)键合相是常用的代表,可完成HPLC分析任 务的80%。 中等极性键合相: 如键合醚基,可分离能形成氢键的化合物(如酚 类)
8
分配色谱
吸附色谱
凝胶过滤 色谱
大孔树脂 色谱
离子交换 色谱
9
+ 物理吸附:硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行 的吸附色谱;
+ 化学吸附:黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生 物碱被酸性硅胶吸附等;
+ 半化学吸附:聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合 物之间的氢键吸附,吸附力较弱,介于物理吸附 与化学吸附之间。
6
+ 硅胶 + 活性炭 + 离子交换树脂 + 大孔吸附树脂 + 氧化铝
+ 凝胶 + 纤维素衍生物 + 环糊精 + 聚丙烯酰胺
7
+ 硅胶:应用广泛,适合各类成分
+ 氧化铝:主要用于碱性或中性亲脂性成分,如生 物碱、甾体、萜类等
+ 活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类
+ 聚酰胺:主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及 鞣质等成分
正相分配色谱:流动相极性< 固定相极性 反相分配色谱:流动相极性>固定相极性
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液相色谱类型
+ 正相色谱:固定相为极性,流动相为非极性。 + 反相色谱:固定相为非极性,流动相为极性。
用的最多,约占60~70%。
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+ 1.环境污染物分析:大气、水、土壤和食品中的多 环芳烃、多环联苯,阴离子表面活性剂,有机氯农 药、有机磷农药,除草剂,酚类胺类,黄曲霉毒素 等污染物的分离与鉴定。
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+ 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团,如 (NH2)和氰基团(CN)的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基团极性较强,因此, 分离的次序是依据样品中各组分的极性大小,即极性较弱的组份最先 被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如正 已烷,氯仿,二氯甲烷等。
4
色谱分离的几个概念 所有的色谱分离操作均分为:装柱、上样、层
析、洗脱。 其中的固定不动的相,称为固定相; 携带试样混合物流过此固定相的流体,称为流
动相; 作为流动相的液体或气体,称为洗脱剂; 洗脱时从柱中流出的溶液,称为洗脱液; 加入洗脱剂使各组分分层的操作,叫层析,也
+ 常用的极性吸附剂:硅胶、氧化铝。 + 常用的非极性吸附剂:活性炭。
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凝胶过滤色谱(凝胶渗透色 谱、分子筛滤过色谱、排阻 色谱)
原理Leabharlann Baidu分子筛作用
葡聚糖凝胶(sephadex G) 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)
11
12
原理:可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换,并被吸附,用适当的溶剂 从柱上洗脱下来,实现物质的分离。
+ 2.精细化工:在精细化工生产中使用的具有较高分 子量和较高沸点的有机化合物,如高碳数脂肪族或 芳香族的醇、药物、燃料,工业产品的醛、酮、醚、 酸、酯等化工原料,以及各种表面活性物质的分离 与测定。
+ 3.食品、药品质量分析:药物残留,防腐剂、抗氧 化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定, 保健食品中的功效成分检测,真菌毒素分析等。
+ 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱 官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强,通常为水、缓 冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的 组分最先被冲洗出,而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5 (Phenyl)等。
2
+ 色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展, 并发展出一个独立的三级学科-色谱学。
+ 1952年英国科学家阿切尔·马丁、理查 德·辛格因发明了分配色谱法而共同获得 诺贝尔化学奖,此外色谱分析方法还在12 项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关 键作用。
3
+ 应用范围广 复杂混合物,有机同系物,异构体,手性异构体。 气相色谱:沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱:高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
+ 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O<甲醇<乙腈<乙醇 <丙醇<异丙醇<四氢呋喃
+ 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇
叫展开。
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色谱过程的本质是待分离物质分子在固 定相和流动相之间分配平衡的过程,不同 的物质在两相之间的分配会不同,这使其 随流动相运动速度各不相同,随着流动相 的运动,混合物中的不同组分在固定相上 相互分离。
不同组分在色谱分离过程中分离情况取 决于各组分在两相间的分配系数、吸附能 力、亲和力等的差异。
+ 分离效率高 若用塔板理论数来表示色谱柱的效率,每米柱长可达几 千至几十万的塔板数,特别适用于极复杂混合物的分离, 且通常收率、产率、和纯度都较高。
+ 操作模式多样 可通过选择不同的操作模式,以适应不同样品的分离。
+ 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
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+ 关于色谱分离方法的研究始于1901年,俄国植物 学家 Tswett(茨维特)在研究植物叶子的组成 时,用碳酸钙填充竖立的玻璃管,以石油醚洗脱 植物色素的提取液,经过一段时间洗脱之后,植 物色素在碳酸钙柱中实现分离,由一条色带分散 成三种颜色的6个色带。
+ 两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现 象及其在生化分析上的应用”,提出了应用吸附 原理分离植物色素的新方法,在这一方法中把玻 璃管叫做“色谱柱”,碳酸钙叫做“固定相”, 石油醚叫做 “流动相”。三年后,他将这种方 法命名为色谱法(Chromatography)。
吸附规律 阳离子交换树脂—分离碱性成分 阴离子交换树脂—分离酸性成分
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大孔吸附树脂
吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体,二乙烯苯 为交联剂(非极性) 吸附力:范德华力或氢键 工艺流程:树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的 解吸→树脂的清洗、再生。
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原理:被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同。
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化学键合相
利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键 合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。 种类 非极性键合相:
如键合C18、C8、苯基等,其中十八烷(ODS或 C18)键合相是常用的代表,可完成HPLC分析任 务的80%。 中等极性键合相: 如键合醚基,可分离能形成氢键的化合物(如酚 类)
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分配色谱
吸附色谱
凝胶过滤 色谱
大孔树脂 色谱
离子交换 色谱
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+ 物理吸附:硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行 的吸附色谱;
+ 化学吸附:黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生 物碱被酸性硅胶吸附等;
+ 半化学吸附:聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合 物之间的氢键吸附,吸附力较弱,介于物理吸附 与化学吸附之间。
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+ 硅胶 + 活性炭 + 离子交换树脂 + 大孔吸附树脂 + 氧化铝
+ 凝胶 + 纤维素衍生物 + 环糊精 + 聚丙烯酰胺
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+ 硅胶:应用广泛,适合各类成分
+ 氧化铝:主要用于碱性或中性亲脂性成分,如生 物碱、甾体、萜类等
+ 活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类
+ 聚酰胺:主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及 鞣质等成分
正相分配色谱:流动相极性< 固定相极性 反相分配色谱:流动相极性>固定相极性
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液相色谱类型
+ 正相色谱:固定相为极性,流动相为非极性。 + 反相色谱:固定相为非极性,流动相为极性。
用的最多,约占60~70%。
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+ 1.环境污染物分析:大气、水、土壤和食品中的多 环芳烃、多环联苯,阴离子表面活性剂,有机氯农 药、有机磷农药,除草剂,酚类胺类,黄曲霉毒素 等污染物的分离与鉴定。
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+ 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团,如 (NH2)和氰基团(CN)的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基团极性较强,因此, 分离的次序是依据样品中各组分的极性大小,即极性较弱的组份最先 被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如正 已烷,氯仿,二氯甲烷等。
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色谱分离的几个概念 所有的色谱分离操作均分为:装柱、上样、层
析、洗脱。 其中的固定不动的相,称为固定相; 携带试样混合物流过此固定相的流体,称为流
动相; 作为流动相的液体或气体,称为洗脱剂; 洗脱时从柱中流出的溶液,称为洗脱液; 加入洗脱剂使各组分分层的操作,叫层析,也
+ 常用的极性吸附剂:硅胶、氧化铝。 + 常用的非极性吸附剂:活性炭。
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凝胶过滤色谱(凝胶渗透色 谱、分子筛滤过色谱、排阻 色谱)
原理Leabharlann Baidu分子筛作用
葡聚糖凝胶(sephadex G) 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)
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原理:可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换,并被吸附,用适当的溶剂 从柱上洗脱下来,实现物质的分离。
+ 2.精细化工:在精细化工生产中使用的具有较高分 子量和较高沸点的有机化合物,如高碳数脂肪族或 芳香族的醇、药物、燃料,工业产品的醛、酮、醚、 酸、酯等化工原料,以及各种表面活性物质的分离 与测定。
+ 3.食品、药品质量分析:药物残留,防腐剂、抗氧 化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定, 保健食品中的功效成分检测,真菌毒素分析等。
+ 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱 官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强,通常为水、缓 冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的 组分最先被冲洗出,而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5 (Phenyl)等。
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+ 色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展, 并发展出一个独立的三级学科-色谱学。
+ 1952年英国科学家阿切尔·马丁、理查 德·辛格因发明了分配色谱法而共同获得 诺贝尔化学奖,此外色谱分析方法还在12 项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关 键作用。
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+ 应用范围广 复杂混合物,有机同系物,异构体,手性异构体。 气相色谱:沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱:高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。