慢病毒包装知识大全

在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。

病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

一、慢病毒载体构建原理：

慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基

因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。

慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。

二、慢病毒载体构建及包装流程：

（一）实验流程（1和2为并列步骤）

1.慢病毒过表达质粒载体的构建

设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目

的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。

2.慢病毒干扰质粒载体的构建

合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体3.慢病毒载体的包装与浓缩纯化

制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

（二）实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株

该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2,pMD2G,

pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、慢病毒转染细胞实验方法

（一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法

1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。

2、第二天，用含有6μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。

3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。

4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。

（二）慢病毒转染悬浮细胞实验方法

1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6μg/ml和适量病毒，

充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染

的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。

2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)

加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。

3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。

病毒感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：1.感染时的培

养基尽量少些；2.每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene（储存

液浓度为2mg/ml），可以提高效率约3-5倍。不过病毒感染效率的

问题都是相对的，达到自己的研究目的即可。

此过程需要有脂质体，在脂

质体的协助下将用于包装病

毒的三质粒经胞吞作用导入

到细胞内进行病毒包装，然

后再收集病毒，最后进行病

毒转染，获得稳转细胞系

病毒感染细胞本来效率就较低，整个过程相对复杂难操作，一般一次花费周期至少两三个月，多则几个月到十几个月不等，经费也是几万到十几万。万一实验失败需要重复操作会花费更多的时间和开支。所以有效提高病毒转染效率是病毒转染细胞的关键。