基因工程的载体和工具酶

第二章基因工程的载体和工具酶

【教学时数】9小时

【教学目录与学时分配】

2.1 载体（6）

2.1.1 质粒载体

2.1.2 噬菌体载体

2.1.3 其他载体

2.1.4 穿梭载体与表达载体

2.2 工具酶（3）

2.2.1 限制性内切核酸酶

2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段

2.2.3 DNA连接酶

2.2.4 碱性磷酸酶

2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶

【教学目的】

让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。

【教学重点】

常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。

【教学难点】

基因工程载体的结构和使用

【教学方式】

多媒体讲解结合启发讨论式教学

第一节载体

一、质粒载体（3）

【教学重点】

质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的克隆过程

【教学难点】

质粒的结构

【教学过程与内容】

载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。

2.1.1 质粒载体

质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。

质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。

一、质粒的基本特性

1．质粒的复制

通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制

的方式，如滚环复制和θ复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。

2．质粒的拷贝数

质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。

3．质粒的不相容性

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。

4．转移性

质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因mob，转移基因tra ，顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic。

二、标记基因

（一）选择标记

抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。

1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, amp r）

氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。

2．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tet r）

四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。

3．氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cm r, cat）

氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。

4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kan r, neo r）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3'）-Ⅱ, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。

（二）筛选标记

筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。

1．α-互补（α-complementation）

α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac 操纵子中的lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在