第三章 基因工程常用的克隆载体
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基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
第三章基因工程载体
16
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
第三章 基因克隆载体
（2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒
（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）
乳酸杆菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。 质粒宿主范围广泛：可用于其它G+菌及大肠杆菌。 构建： 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。 标记基因： 选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的
一、质粒适于载体构建的性质
１、组成与构型 质粒(plasmid)是染色体外裸 露的双链DNA分子（细菌、真 菌、蓝藻、绿藻）
l-DNA 构型： oc-DNA
２、分子大小： 100～102 kb
３、复制 特点：在宿主细胞内进行单向复制。 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度： 拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳 定。
BR：两位主要构建者 322：实验编号
ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。衍生的pMB1 为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好 的选择标记基因和克隆位点）。
pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧 型，含有Tcr 基因。
构建过程(出发质粒：pMB1)
R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19
这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。
用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞 只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选 育转基因植物。
（2）Vir区
位于T-DNA区上游，其表达产物可激活TDNA的转移，显示致瘤性。
（3）Con区
含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)， 可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌 间转移，也即接合转移基因编码区。
基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]
![基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/d56699a9ddccda38366baf0a.png)
融合蛋白质克隆载体克隆外源基因示意图
表达融合体蛋白质策略的优点：
（1）克隆的外源基因能有效 转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位 输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。
非融合蛋白表达载体：
二、噬菌体克隆载体
λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环 状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。 形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期， 是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操 作。
不含对受体有害基因不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节克隆载体的一般特征一细菌质粒载体第二节原核生物基因克隆载体细菌质粒载体是以细菌质粒dna分子为基础构建的克隆载体主克隆载体
• DNA重组（限制性内切酶） • 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
pBR322
（6524bp)
λDNA：cos序列和控制包装序列
pBR322
质粒的复制子 抗药性基因 多克隆位点区
克隆能力：31—45kb
（二） Cosmid载体的应用程序
应用柯斯质粒载体，在大肠 杆菌细胞中克隆大片段的真 核基因组DNA技术，叫做柯 斯克隆（cosmid cloning）。
表达融合体蛋白质策略的优点：
（1）克隆的外源基因能有效 转译。 （2）表达的蛋白质稳定。 （3）可以加入信号肽，定位 输送蛋白质。 （4）利于分离纯化。
非融合蛋白表达载体：
二、噬菌体克隆载体
λ DNA： ——在噬菌体中是线状DNA分子，进入寄主细胞后呈环 状DNA分子。 ——长48kb。 ——左右两端各有12bp组成的彼此完全互补的粘性末端。 形成cos位点。 ——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期， 是必要基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操 作。
不含对受体有害基因不任意转入其它细胞尤其是人体细胞第一节克隆载体的一般特征一细菌质粒载体第二节原核生物基因克隆载体细菌质粒载体是以细菌质粒dna分子为基础构建的克隆载体主克隆载体
• DNA重组（限制性内切酶） • 运输工具——基因克隆载体 • 目的基因的制备 • 目的基因导入受体细胞 • 外源基因的表达 • 基因工程的应用
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
pBR322
（6524bp)
λDNA：cos序列和控制包装序列
pBR322
质粒的复制子 抗药性基因 多克隆位点区
克隆能力：31—45kb
（二） Cosmid载体的应用程序
应用柯斯质粒载体，在大肠 杆菌细胞中克隆大片段的真 核基因组DNA技术，叫做柯 斯克隆（cosmid cloning）。
用于基因克隆的载体
Xgal显色、抗菌素双重直接选择。 测序方便
. pGEM-3Z
由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。
添加标题
T7启动子
添加标题
SP6启动子
添加标题
MCS
添加标题
lacZ’
添加标题
Ampr
添加标题
ori
添加标题
可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。
质粒的分子形式
线状双螺旋（两个裂口）
开环双螺旋（一个裂口）
双螺旋共价闭合环（超螺旋）
共价闭合环状DNA（cccDNA)
Covalent close circular DNA
添加标题
01
呈超螺旋（SC）（super coil）
添加标题
02
开环DNA（ open circular， ocDNA）
一条链上有一至数个缺口。 线形DNA （ linear ，L-DNA）
pBR322 4363
抗药性标志的选择
pBR322
Amp
Tet
插入片段
Amp平板
Tet平板
单击此处添加小标题
单击此处添加小标题
单击此处添加小标题
拷贝数 2000 - 3000 / cell
用于基因克隆和测序
装有多克隆位点（MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
打开率
35%
25%
20%
10%
3.2.8.2 pUC18 / 19：
受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal
添加标题
受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a
. pGEM-3Z
由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。
添加标题
T7启动子
添加标题
SP6启动子
添加标题
MCS
添加标题
lacZ’
添加标题
Ampr
添加标题
ori
添加标题
可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。
质粒的分子形式
线状双螺旋（两个裂口）
开环双螺旋（一个裂口）
双螺旋共价闭合环（超螺旋）
共价闭合环状DNA（cccDNA)
Covalent close circular DNA
添加标题
01
呈超螺旋（SC）（super coil）
添加标题
02
开环DNA（ open circular， ocDNA）
一条链上有一至数个缺口。 线形DNA （ linear ，L-DNA）
pBR322 4363
抗药性标志的选择
pBR322
Amp
Tet
插入片段
Amp平板
Tet平板
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拷贝数 2000 - 3000 / cell
用于基因克隆和测序
装有多克隆位点（MCS）
正选择颜色标记 lacZ’
打开率
35%
25%
20%
10%
3.2.8.2 pUC18 / 19：
受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal
添加标题
受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a
《基因工程》第三章 载体2
Induction
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
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标记基因：apr、tcr
分子大小：4363bp 拷贝数：50-100/cell
pBR322
Sal I
4363 bp
ROI ROP Origin of Replication Hind II Bal I
EcoRI
SstI
KpnI
SmaI BamHI XbaI
SalI
PstI
SphI
HindIII
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
质粒DNA纯度较低、周期较短！
复制特性
拷贝数：生长在标准培养基条件下，每个细胞中所含有的质粒DNA分 子的数目 严紧型复制：1-2个 松弛型复制：10-100个
制备质粒：寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑 制剂，增加质粒拷贝数！
三、质粒载体应具备的条件
具有复制起始位点 具有至少两种易被检测的选择性标记 具有多克隆位点（MCS）
六、 l-DNA作为载体的优点
λ DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 λ DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组λ DNA分子的筛选较为方便
LOGO
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
cΙ 基因：编码阻遏蛋白，使参与溶菌周期活动的基因失活
cΙ 基因表达：溶源途径 cΙ 基因不表达：溶菌途径 形成浑浊噬菌斑 形成噬菌斑
四、 λ噬菌体载体的构建
消除多余的限制性内切酶位点 点突变 基因组置换、缺失 增加单一酶切位点 去除非必要区段 λ 噬菌体头部蛋白可包装DNA大小：75～105% λ DNA长度 （38～52kb） 增加筛选标记基因
提取纯化质粒DNA： 氯化铯-溴乙锭密度梯度离心 法（CsCl-EtBr）
质粒DNA纯度高、周期长、 设备要求高、存在溴乙锭污 染！
变性特性
cccDNA由于分子较小且结构紧密，碱性条件下变性后，恢复pH条 件即可复性。
提取纯化质粒DNA： 微量碱变性法
裂解菌体细胞 加NaAc调pH至4.8 加碱调pH至12～12.5 离心 去除蛋白质、RNA DNA变性
多克隆位点（multi-cloning-site，MCS）：多种常用限制酶单一 识别序列所组成的DNA序列
具有尽可能小的相对分子质量
易于分离纯化 目的DNA装载能力强 拷贝数高 多重酶识别位点几率低
应属于松弛型复制 应为非传递型
四、几种常用的质粒载体
pBR322 来源：大肠杆菌 Ori： EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I Pvu I Pst I Apr Tcr
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
第一节 质粒载体
一、质粒的定义
存在于细胞质中的一类独立于染色体，并能自主 复制的遗传成分（复制子）
复制子:细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位 染色体DNA 质粒DNA 噬菌体DNA
二、质粒DNA分子的特性
结构特性
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA，covalently closed circular DNA ） OC型 开环DNA（ocDNA，open circular DNA ） L 型 线性DNA（L-DNA，line DNA）
染料结合特性：
呈平面结构的染料（EB）可平嵌入DNA双链碱基对之间。cccDNA 由于结构紧密，自由末端较少，可结合染料EB分子比L-DNA少，因此密度 较大。
不表达阻遏蛋白
体外包装
β -半乳糖苷酶失活的插入型载体
表达酶
蓝色混浊噬菌斑
LacZ基因
插入片段
LacZ基因
不表达酶
无色混浊噬菌斑
替换型载体： 又称取代型载体。在λ DNA可替换片断两端具有两个限制 酶位点，酶切后可替换片断与左右翼分开，由外源DNA片断取 代
特点：承载能力大 筛选标记： λ DNA大小 β -半乳糖苷酶基因替换
侵染
E.coli
溶源菌
裂解
浑浊噬菌斑
三、 λDNA的结构及功能
COS 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ 3’ COS 5’ TCCAGCGGCGGGG
溶菌控制基因
cos
R
A
头部合成基因
晚期控制基因
DNA合成控制基因 阻遏基因(cΙ 、cⅡ) 早期控制基因
N
l - DNA
尾部合成基因
J 左臂区：A→J 中间区：J →N 右臂区：N →R
一、基本概念
噬菌体感染周期：
E.coli
裂解
吸附 注入 复制
包装
溶菌途径 溶源途径
烈性噬菌体 温和噬菌体 原噬菌体 营养体 溶源菌
整合
二、 λ噬菌体的形态结构及繁殖特性
形态结构
头部：正二十面体、 直径约55nm λ DNA：线性、约48kb
尾部：长约150nm、粗 12nm
繁殖特性
λ 噬菌体
质粒DNA编码的表型
抗性特性 抗生素抗性： Ampr
Cmlr Kanr Strr Tetr
重金属抗性： Hg、Ni、Co、Pd、Zn 毒性阴离子： 砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐 其他： 嵌入试剂（EB、吖啶）、辐射、噬菌体
代谢特性： 冠瘿碱代谢 修饰寄主生活方式： 植物冠瘿病、发根病
五、 λ噬菌体载体的主要类型
插入型载体： λ DNA缺失部分非必要基因，只含有一个或两个可供外源 DNA插入的酶切位点
特点：承载能力较小（<10kb） 筛选标记：基因插入失活
免疫功能失活的插入型载体 β -半乳糖苷酶基因失活的插入型载体
免疫功能失活的插入型载体
表达阻遏蛋白 CΙ 基因
插入片段 CΙ 基因
lacZ'
pUC18
2686 bp Ar、lacZ’ MCS： 分子大小：2686bp 拷贝数：1000-2000/cell
第二节 λ噬菌体载体
λ 噬菌体DNA可以作为克隆载体的原因：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 λ DNA缺失达总量20%的DNA时，仍不影响其特性，可为外源 基因提供装载空间