7 间充质干细胞无血清培养基
无血清培养基分离并鉴定U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞
无血清培养基分离并鉴定U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞摘要】目的应用无血清培养基分离U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞，并鉴定相关肿瘤标志物表达。
方法体外培养人骨肉瘤U2OS细胞株和U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞，免疫荧光检测U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞球中CD105表达。
采用免疫印迹法检测人骨肉瘤U2OS细胞株和U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞Nanog和Oct4蛋白表达。
采用半定量PCR检测人骨肉瘤U2OS细胞株和U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞SOX2、Nanog和Oct4 mRNA的表达。
结果荧光显微镜下可见，U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞球中部分细胞CD105呈阳性表达。
免疫印迹检测结果显示人骨肉瘤U2OS细胞株的Nanog和Oct4蛋白相对表达量为0.853±0.404和0.603 ±0.153，均明显低于U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞0.973±0.305 和0.827±0.322（均p<0.05）。
半定量PCR检测结果显示U2OS人骨肉瘤肿瘤干细胞SOX2、 Nanog和Oct4 mRNA的相对表达量为0.190±0.027、0.178±0.025、0.170±0.021，均明显高于人骨肉瘤U2OS细胞株0.032±0.009、0.086±0.016、0.019±0.006（均p<0.05）。
结论人骨肉瘤U2OS细胞株中存在肿瘤干细胞，无血清培养可用于分离培养人骨肉瘤肿瘤干细胞。
【关键词】骨肉瘤骨肉瘤干细胞无血清培养基悬浮培养【中图分类号】R730 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）31-0073-02骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，多见于青少年。
是恶性程度最高的肿瘤之一[1] 。
尽管化疗结合手术的新型治疗方法改善了患者预后，但骨肉瘤患者在联合化疗时耐药患者的比例高于30%[2, 3] ，对于已转移的骨肉瘤，生存率并没有得到显著的提高，患者长期存活率只有65%左右。
骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养
骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养准备工作（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。
（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG 培养液（美国GIBCO）（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。
实验前准备（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。
配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。
（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。
（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
穿隔离衣，戴手套。
用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。
点燃酒精灯，安装吸管帽。
实验步骤（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。
依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。
细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。
（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
大鼠骨髓间充质干细胞在海马神经元培养基中的定向分化
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解剖学杂志
２１ ０ ０年 第 ３ 第 ３ ３卷 期
大 鼠骨 髓 间充质 干 细胞在 海 马神 经 元培 养基 中的定 向分化
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无血清培养基体外分离培养人胶质瘤干细胞与鉴定
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间充质干细胞条件培养基对HPV18型阳性人子宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响
间充质干细胞条件培养基对HPV18型阳性人子宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响作者：邱杰洪张昌林李田来源：《新医学》2021年第04期【摘要】目的观察人脐带间充质干细胞条件培养基（MSC-CM）对HPV18型阳性人子宫颈癌HeLa细胞（HPV18 HeLa细胞）凋亡相关基因的調控作用，以及对HPV18 HeLa细胞凋亡的影响。
方法制备MSC-CM，设置空白组、低剂量组和高剂量组，配制相应浓度分别为0%、20%和60%的MSC-CM处理HPV18 HeLa细胞，使用CCK-8法、克隆形成实验检测细胞活力和克隆形成能力;磷脂结合蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法凋亡染色和流式细胞术检测细胞凋亡的变化;实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因mRNA表达量。
结果与空白组相比，在低剂量组或高剂量组的MSC-CM作用下，HPV18 HeLa细胞的生长活性和克隆形成能力均降低，细胞凋亡率升高（P均< 0.05），且高剂量组作用效果均比低剂量组明显（P均<0.05）。
与空白组相比，HPV18 HeLa细胞在低剂量或高剂量组MSC-CM的作用下，HPV18 HeLa细胞中p53、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、Caspase-9、Bax的mRNA表达量升高，而B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的mRNA表达量降低（P均< 0.05），高剂量组比低剂量组的作用效果更明显（P < 0.05）。
结论 MSC-CM能诱发HPV18 HeLa细胞凋亡，可能与p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax以及Bcl-2等基因表达差异相关。
【关键词】人乳头瘤病毒18型;宫颈癌;HeLa细胞;间充质干细胞;细胞凋亡Effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium on apoptosis of HPV18-infected HeLa cell lines Qiu Jiehong， Zhang Changlin， Li Tian. Department ofGynecology and Pelvic Floor Disorders Center， the Seven Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Shenzhen 518107， ChinaCorresponding author， Li Tian， E-mail：*******************【Abstract】 Objective To evaluate the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium （MSC-CM） on regulating the apoptosis-related genes and determine the impact upon the apoptosis of human papillomavirus type18-infected HeLa cell lines. Methods Primary cervical cancer HeLa cells were divided into the blank， low-dose and high-dose groups. HeLa cells were cultured and treated with 0%， 20% and 60% of MSC-CM in three groups， respectively. The cell viability and clone formation ability of HeLa cells were detected by CCK-8 assay and clone formation assay. The apoptosis of HeLa cells was detected by Annexin V-Fluorescein isothiocyanate/Propidium iodide （V-FITC/PI） staining and flow cytometry. The expression levels of p53， Bax， Caspase-3， Caspase-9 and Bcl-2 mRNA in HeLa cells were quantitatively measured by RT-PCR. Results In the low- and high-dose groups， the cell viability and clone formation ability were significantly decreased， whereas the apoptosis rate was significantly elevated compared with those in the blank group （all P < 0.05）. The effects in the high-dose group were more evident than those in the low-dose group （all P < 0.05）. The expression levels of p53， Bax， Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in the low- and high-dose groups were significantly up-regulated， whereas that of Bcl-2 mRNA was significantly down-regulated compared with those in the blank group （all P <0.05）. The effects in the high-dose group were more pronounced than those in the low-dose group （all P < 0.05）. Conclusions Under the effect of MSC-CM， the apoptosis of HPV18 cervical HeLa cells can be induced， probably associated with the differential expression patterns of p53， Bax，Bcl-2， Caspase-3 and Caspase-9 mRNA.【Key words】 Human papillomavirus type18;Cervical cancer;HeLa cell;Mesenchymal stem cells;Apoptosis人乳头瘤病毒（HPV）是一种闭合双链DNA病毒[1]。
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AdvCell® 间充质干细胞无血清培养基
AdvCell® 间充质干细胞无血清培养基（BSFMOO01）根据干细胞的生长需要，培养基包含必需和非必
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质干细胞基础培养基 （BM0001）、AdvCell® 干细胞培养添加剂 A（SCM0001A）以及AdvCell® 干细胞
培养添加物 B（SCM0001B）于37℃解冻并迅速混合。
2.完全培养基的存储：配制好的完全培养基放在4℃冰箱避光保存，并尽量在一个月内使用完。
3.根据需要，培养过程中可添加一定剂量青霉素∕链霉素(P∕S)。
4.为达到最佳培养效果，所有细胞培养皿或培养瓶在接种细胞前用细胞垫材料（Cellpad）（BCP0001）包
被过夜或室温包被2小时，包被后用吸管取走多余的 AdvCell® 细胞垫材料（BCP0001），再接种胞。
5.如客户用自己配制的冻存液冻存的细胞是用作临床治疗，应避免用甘油作为保护剂。
★ 培养条件
37℃，5%CO2 ，无菌恒温培养箱培养。
★ 细胞培养
【复苏】
1.将配置好的完全培养基放入37℃水浴中预热5-15 min；
2.从液氮中取出干细胞迅速放入37℃水浴快速解冻（解冻后不要继续孵育细胞）；
3.在超净台中加入5 ml的 完全培养基重悬细胞，1000 rpm离心5 min；
4.弃上清，加入 5 ml的完全培养基重悬细胞，转移到T-25培养瓶中（带滤芯）；
5.将培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养；
6.第二天用新鲜的 完全培养基给细胞换液。
【 培养】
1.在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80%时，即可传代；
2.37℃水浴预热完全培养基；
3.在超净台中，弃掉T-25细胞培养瓶中的培养基，加入2 ml PBS清洗，再加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA
消化细胞；
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4.在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5 ml 完全培养基终止消化；
5.用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；
6.将细胞转移到15 ml离心管中，1000 rpm离心5 min；
7.弃上清,加入15-20 ml的 完全培养基重悬细胞后转入T-75细胞培养瓶中或按适当比例传到T-25细胞
培养瓶中。确保后融合度在25-50%之间，细胞密度在1×104cells/cm2 （2.5×105 cells/T-25瓶），
混合细胞悬液，确保细胞均匀分布；
8.将细胞培养瓶置于37℃，5%CO2 的无菌恒温培养箱中培养；
9.每两天用新鲜、预热的完全培养基进行换液。
【冻存】
1.细胞消化和计数，用胰酶对待冻存的细胞进行消化，并对细胞进行计数。
2.1000 rpm离心5 min，去掉上清。
3.根据细胞计数的情况，加入适量的冻存液，使细胞密度在1×106/ml左右（或根据自己希望达到的细胞
密度）。
4.轻轻地重悬细胞（务必重悬均匀），将重悬的细胞按等份加入到灭菌的冻存管（需提前做好标记或者贴
上标签）中，旋紧冻存管盖。
5.将冻存管放入程序降温冻存盒中，然后将冻存盒直接放入-80℃。
6.第二天将细胞从-80℃转移到液氮中。