《中国药典》2015年版微生物培训2
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2015版中国药典微生物检验
• 注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查非无菌产品微生物限度检查
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告 菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管 数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
培养条件
• 描述方式：按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～ 35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3～5天。
2015版中国药典微生物限度解析
10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
《中国药典》2015年版三部凡例培训
LOGO
半成品配制后直接分装至终容器时，如采用不同分装机进行分装，应按
分装机划分不同批或亚批； 半成品配制后经同一台分装机分装至终容器，采用不同冻干机进行冻干， 应按冻干机划分不同亚批。 非同日或同次配制、混合、稀释、过滤、灌装的半成品不得作为一批。 同一制品的批号不得重复；同一制品不同规格不应采用同一批号。
6
7 8
冻干要求
分装பைடு நூலகம்冻干 标识和记录
抽样、检定
生物制品包装规程
• 标签的要求
药品的标签是指药品包装上印有或者贴有 的内容，分为内标签和外标签。药品内标 签指直接接触药品的包装的标签，外标签 指内标签以外的其他包装的标签。
1、应符合国家法规要求； 2、文字表述应以药品监管理部门批准的为依据，不得超出说明书内容， 不得加入无关的文字和图案； 3、内包装标签和外包装标签的内容、格式应符合法规要求。
批：指在同一生产周期中，用同一批原料、同一方法生产所得的一定数量、均 一的一批制品。
凡例内容（一）
总则
正文（各论）
精确度
凡例
通则
基本要求
名称及编排
凡例内容（二）
生物制品术语与名称解释
检定方法与限度
常用英文名称 缩写与注释
凡例
计量
包装、标签、使用说明、 贮藏、运输
标准品、参考品、对照品
精确度
称重或量取的量，其精确度可根据数值的有效数 位来确定，如：
试验用水：
除另有规定外，系指纯化水；酸碱度检查用的水，均系指新煮沸并 放冷至室温的水。
试验时的温度：
未注明者，系指在室温下进行；如温度高低对试验结果有显著影响者， 除另有规定外，应以25±2℃为准。 酸碱性试验，如未指明用何种指示剂，均系指石蕊试纸。
《中国药典》2015年版微生物计数法实例
SDA
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （薄膜过滤法）
试验组
（样+菌）
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液，供试 液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液，使试管中含菌量不大于 100cfu/mL，吸取1mL进行薄膜过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗， 100mL/次，滤膜贴在相应的培养基上。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的 供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
/
/
T/S
0.92
0.91
0.92
1.07
1.08
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应 在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：霉菌和酵母菌总数计数培养基适用性检查结果（SDA）
菌种
被检培养基菌落数 （T）
中国药典2015版 四部 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则110 7），特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu，那么最高稀释级是1：10 3 。
2015版中国药典微生物限度
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
3. MPN 法
– 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的 方法进行供试液制备和供试品接种，所有试 验管在30～35℃培养3～5 天，如果需要确 认是否有微生物生长，按方法适应性试验确 定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长 的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需 氧菌总数的最可能数。
1.5结果判断
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。
– 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
3. MPN 法
– 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的 方法进行供试液制备和供试品接种，所有试 验管在30～35℃培养3～5 天，如果需要确 认是否有微生物生长，按方法适应性试验确 定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长 的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需 氧菌总数的最可能数。
1.5结果判断
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。
– 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
2015版中国药典微生物限度培训-2014
27
培养基
环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆 胨琼脂培养基（TSA） 当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖 琼脂培养基(SDA)。
28
请根据报告内容更新
培养条件GBT 16293-2010 医工业洁净室（区）浮游菌的测试方法
USP1116 无菌工艺环境的微生物控制与监测
41
Presentation title in footer | 00 Month 0000
四、培养基体系
最突出的变化：微生物质控分类及培养基体系 2010版 分类依据 项目1 项目2 按微生物类别分 细菌数 营养琼脂 霉菌及酵母菌数 玫瑰红钠琼脂 2015版 按营养条件分 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）
12
Presentation title in footer | 00 Month 0000
尘埃粒子监测
监测方法：参照GB/T 16292-2010 《医药工业洁净室（区）悬浮粒 子的测试方法》 监测设备：
空气尘埃粒子计数器，多为光散射粒子计数器
工作原理： 当取样气流中的尘埃颗粒通过计数器散射腔的光敏感区时，光 遇到粒子时发生散射，这些光脉冲信号经光电二极管转换成电脉冲 信号，电脉冲次数反映粒子数，脉冲幅值反映粒子的粒径。 一台仪器可同时测定多个粒径通道的粒子。
采样点
不得少于2个
14
请根据报告内容更新
采样量
15
请根据报告内容更新
尘埃粒子标准
16
请根据报告内容更新
容易被忽略的UCL值：
UCL的计算：平均值均值的95%置信上限，微粒每立方米 （粒/m3）
《中国药典》试题(无答案版)
《中国药典》2015年版三部题库一、填空题1.《中国药典》由（）组成，药典一部收载药材和饮片、植物油腊和提取物、成方制剂和单味制剂等；药典二部收载化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品等；（）收载生物制品；各部内容分别包括凡例、正文（各论）和通则。
本版药典新增第四部，集中收载（），为便于药典使用，对部分正文（各论）品种常用的通则亦列于各部之后。
2.药品通用名称是通过一个（）、（）、为公众所属的名称，也即（），对一种药用物质或活性成分的识别。
生物制品通用名称是（），是生物制品（）、（）的主要内容之一，也是生物制品（）的重要组成部分。
3.疫苗的名称由（）、（）或（）加“（）”组成，根据具体情况，增加（）、（）（人用，治疗用）、（）（原代/传代细胞）、对微生物或其组分的特定描述（如减毒/灭活、全毒素/裂解、多价/n价、联合/结合等）。
4.生物制品指以（）等为起始原材料，用生物学技术制成，用于预防、治疗和诊断人类疾病的制剂，如（）、（）、（）、（）、（）、（）等。
5.多价疫苗由同种病原微生物（）混合制成的疫苗为多价疫苗，如A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、双价肾综合征出血热灭活疫苗。
6.生物制品标准物质是指用于（）、（）测定的或其他特性鉴别、检查的生物标准品、生物参考品。
7.生物制品标准物质分为两大类：（）、（）。
8.国家标准品是指国际生物标准品标定的，或由中国自行研制的（尚无国际生物标准品者）用于定量层顶某一制品（）的标准物质，其含量以毫克（mg）表示，生物学活性以（）表示。
9.国家生物参照品是指用（）标定的，或者由中国自行研制的（尚无国际生物参考品）用于（）或（）的生物试剂、生物材料或特异性抗血清；或指用于定量检测某些制品的生物效价的参考物质，如用于麻疹活疫苗滴度或类毒素絮状单位测定的参考品，其效价以特定活性单位（AU）或单位（U）表示，不以国际单位（IU）表示。
10.生物制品生产用辅料系指生物制品配方中所使用的辅助材料，常用的辅料有：（）、（）、（）、防腐剂、助溶剂、矫味剂、稀释剂等。
中国药典2015版-微生物限度检查解析
*
*
注*：限度未做统一规定。
控制菌
*
不得检出沙门菌 （10g） ； 耐胆盐革兰阴性菌应小 于104（1 g）
执行及制定标准的注意事项
执行范围： 生产、贮存、销售过程中的药品 药用原料、辅料 中药提取物、中药饮片 新药标准 进口药品标准复核 药品质量考察及仲裁
标准执行的注意事项： 药典标准出处：中国药典通则项下【微生
或菌株已无使用需要时应及时灭菌销毁”； • 管理：应有程序文件，包括申购、操作、转种传代、纯度特性确认记录，注明名称、标准号、
接种日期、代数、培养基和培养条件、保藏的位置和条件等。
环境
• 实验室的布局和运行 • 环境监测 • 清洁、消毒和卫生
设备
建立仪器设备管理制度 清洁保养制度 操作规程 使用、监控的记录
器、天平、量器等等） 3.供应商评估与现场审计 使用正确的、有严格质量保障的产品
《中国药典》2015年版-微生物限度标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物限度标准。
胆盐革兰阴性菌应小102
不含豆豉、神曲等发酵 5×102 原粉
102
液体口服给药
制剂
含豆豉、神曲等
发酵原粉
103
102
不得检出大肠艾希菌 不得检出沙门菌
耐胆盐革兰阴性菌应小 于 101
固体局部给药 表皮或粘膜不完整
104
102
不得检出金黄色葡萄球
制剂
菌、
表皮或粘膜完整
103
102
铜绿假单胞菌 ；阴道、
药品微生物检验的现状与发展
《中国药典》2015年版微生物基本知识
(3)沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉。
微生物计数用培养基
2010版
2015版
1、营养琼脂用于细菌计数
2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数
4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定
2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定
▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
控制菌项目变化
培养基体系 明显变化
无明显变化
2010版
大肠菌群 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
试验菌
2010版
2015版
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、
白色念珠菌、黑曲霉
白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。
(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。
培养条件
2010版
2015版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
霉菌及酵母菌数：玫瑰 红钠琼脂 23℃~28℃ 5天
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂
30℃~35℃ 3~5天
霉菌及酵母菌总数 （TYMC)：沙氏葡萄糖 琼脂
20℃~25℃ 5~7天
结果判断
计数方法
微生物计数用培养基
2010版
2015版
1、营养琼脂用于细菌计数
2、玫瑰红钠用于霉菌和酵母菌计数
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂用于酵 母菌计数
4、菌液制备用稀释液：0.9％氯化钠 溶液
1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于需氧 菌总数测定
2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数测定
▷ 活动区域的合理规划及区分，提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。
控制菌项目变化
培养基体系 明显变化
无明显变化
2010版
大肠菌群 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
2015版
耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌
沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
《非无菌产品微生物限度检查： 微生物计数法》
试验菌
2010版
2015版
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、
白色念珠菌、黑曲霉
白色念珠菌、黑曲霉
(1)胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞 菌、白色念珠菌、黑曲霉。
(2)胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌。
培养条件
2010版
2015版
细菌数：营养琼脂 30℃~35℃ 3天
霉菌及酵母菌数：玫瑰 红钠琼脂 23℃~28℃ 5天
需氧菌总数（TAMC）： 胰酪大豆胨琼脂
30℃~35℃ 3~5天
霉菌及酵母菌总数 （TYMC)：沙氏葡萄糖 琼脂
20℃~25℃ 5~7天
结果判断
计数方法
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色念珠菌、黑曲霉
色念珠菌、黑曲霉
通用要求变化——菌种及菌液制备
9203：药品微生物实验室质量管理知道原则——菌种
药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机 构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的 商业派生菌株。
标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或 按已验证的方法进行。
9203：药品微生物实验室质量管理指导原则——
“微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进 行”。
9205：药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则——
用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控环境微生物污染情况的 检测和控制。
通用要求变化——试剂和试药
试剂和试药
中和剂、灭火剂和表面活性剂均应对微生物无毒性， 其相互间具有相容性，有利于样品中微生物的分散。
适用性检查：白色念珠菌、黑曲霉于20-25℃培养不超过5天。 与对照培养基比较，比值在0.5-2范围内，且菌落大小、形态一 判断标准 致。
阴性对照：20-25℃培养5天无菌落生长。
培养基适用性检查—示例
名称
沙氏葡萄糖琼脂+抗生素 （当细菌超标引起需氧菌总数超标时用）
阴性对照及培养基适用性检查同沙氏葡萄糖琼脂，增加抑菌性检查试验。
稀释液
1.PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液；
2.PH6.8无菌磷酸盐缓冲液、PH7.2无菌磷酸盐缓冲液、 PH7.6无菌磷酸盐缓冲液；如需要可在上述稀释液灭菌前 加入表面活性剂或中和剂等。
3.0.9%无菌氯化钠溶液。
通用要求变化——培养基
对照培养基 按标准物质管理，由中检院负责研制分 发。
培养基适用性试验 2皿（0.5～2.0），2管（生长良 好）。
目前均使用CMCC。 菌液制备后若在室温下放置应在2小时内使用，若保 存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可 保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
通用要求变化——菌种及菌液制备
中国药典2010年版
中国药典2015年版
大肠埃希菌
铜绿假单胞
金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白
1.液体供试品
2.固体、半固体或粘稠性供试 品
3.需用特殊方法制备的供试液 的供试品：①非水溶性②膜剂 ③肠溶剂结肠溶制剂④气雾剂 与喷雾剂⑤贴剂⑥具抑菌活性 的供试品。
1.水溶性供试品 2.水不溶性非油脂类供试品 3.油脂类供试品 4.需用特殊方式制备供试液的供 试品：①膜剂②肠溶剂及结肠溶 制剂③气雾剂喷雾剂④贴膏剂。
培养基适用性检查—示例
名称
沙氏葡萄糖琼脂培养基/玫瑰红钠琼脂培养基
阴性对照
取已灭菌的培养基15-20ml，注入直径90mm的无菌平皿中，于 20-25℃培养3天。
试验用菌株 白色念珠菌、黑曲霉
接种方法
涂布法：分别接种不大于100cfu试验用菌悬液于该培养基平皿 上； 倾注法：分别接种不大于100cfu试验用菌悬液于直径90mm的 无菌平皿中，倾注约15～20ml培养基，轻轻摇匀。
接种方法 判断标准
涂布法：分别接种不大于100cfu试验用菌悬液于胰酪大豆胨琼 脂平皿上； 倾注法：分别接种不大于100cfu试验用菌悬液于直径90mm的 无菌平皿中，倾注约15～20ml培养基，轻轻摇匀。 适用性检查：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 于30-35℃培养不超过3天；白色念珠菌、黑曲霉于20-25℃培养 不超过5天。与对照培养基比较，比值在0.5-2范围内，且菌落 大小、形态一致。 阴性对照：30-35℃培养3～5天无菌落生长。
适用性检查：30-35℃培养不超过3天，金黄色葡萄球菌、铜绿 假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种后与对照培养基比较，试验菌应 判断标准 生长良好。
阴性对照：30-35℃培养3～5天，培养基呈澄清的液体。
计数方法适用性试验
计数方法适用性试验
2010版
1.术语变化：计数方法的验 证。 2.细菌数测定用三种菌株试 验 3.菌液加入方式：平皿技术 验证时菌液和供试液同时加 入平皿，加菌量为50100cfu。
注：方法选择原则：根据供试品理化特性 和微生物限度标准等因素选择。
通用要求变化——菌种及菌液制备
非无菌产品微生物 限度检查：微生物 计数法中
表1 菌液的制备和 使用项下包括：试 验菌株、试验菌液 的制备方法、计数 培养基适用性检查 以及计数方法适用 性试验。
通用要求变化——菌种及菌液制备
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中 心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保 藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
2015版
1.术语变化：计数方法适用 性试验。 2.需氧菌总数测定用五种菌 株试验。 3.菌液加入方式：菌液加入 供试液中，使每1ml供试液 或每张滤膜所滤过的供试液 中含菌量不大于100cfu，且 所加菌液的体积不超过供试 液体积的1%
计数方法适用性试验—供试品分类及供试液制备
2010版
2015版
抑菌性试验 抑菌性检查：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌。 用菌株 促生长能力：白色念珠菌、黑曲霉
常用抗生素 庆大霉素；氯霉素等
抑菌性：分别接种不少于100cfu试验用菌 接种方法
促生长能力：分别接种不大于100cfu试验用菌
判断标准
白色念珠菌、黑曲霉于20-25℃培养不超过5天，与对照培养基 比较，比值在0.5-2范围内。 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌应不得生长。
格式变化
概述
中国药典2010年版微生物计数法编排方式
检验 量
供试液 制备
培养基适 用性检查
方法验 证
供试品 检查
概述
中国药典2015年版微生物计数法编排方式
计数方 法
培养基适用性检查 和计数适用性检查
供试品检 查
内容变化
中国药典2010年版 适用范围、检验环境、培养条件 检验量 供试液制备 培养基适用性检验 计数方法验证 供试品检查
➢ 若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级 的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行 进一步的处理。
➢ 如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液 可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适 用性试验。
需氧菌总数： 胰酪大豆胨琼脂 30～35℃ 细菌不大于3天，真菌
不大于5天。 霉菌和酵母菌总数：
沙氏葡萄糖琼脂/玫瑰红钠琼脂 20～25℃ 不大于5天
培养基适用性检查—培养条件
嗜热型微生物最适生长温度为45-58℃；嗜温型为25-43℃；嗜冷型 为10～18℃。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的 最适生长温度为37℃，白色念珠菌、黑曲霉最适生长温度是28℃， 均为嗜温性微生物。
2010年版
2015年版
范围 固体培养基
微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基 或按处方配制的培养基均应进行培养基适用 性检查。
加菌 量
50～100cfu
不大于100cfu
培养 温度
培养 时间
判定 标准
营养琼脂：30～35℃ 玫瑰红钠琼脂：23～28℃ 细菌48h 真菌72h
70%
胰酪大豆胨琼脂/胰酪大豆胨肉汤：30～35℃ 沙氏葡萄糖琼脂/玫瑰红钠琼脂：20～25℃
1.胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白 色念珠菌、黑曲霉
2.胰酪大豆胨液体：白色念珠菌、黑 曲霉
3.沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂： 白色念珠菌、黑曲霉
培养基适用性检查
中国药典2010年版
中国药典2015年版
细菌数： 营养琼脂
30～35℃，48h
霉菌及酵母菌数： 玫瑰红钠琼脂 23～28℃，72h
《中国药典》2015年版微生物限度 检查解析
01 PART ONE
非无菌产品微生物限度检查
微生物计数法（通则1105）解析
1 格式和通用要求变化 2 培养基适用性检查 3 计数方法适用性检查 4 供试品检查 5 结果判断 6 新理念
CONTENTS
目
录
格式和通用要求变化
格式变化
中国药典2010年版
去除抑菌作用
判断样品是否有 抑菌作用
无抑菌作用
验证抑菌活性 的去除效果，以 及去除方法对污 染菌生长、检出 的影响
检查
药品微生物检验方法验证的一般程序与环节
计数方法适用性试验
中国药典
2010年版
平皿法
2015年版
试验组
供试液和菌液同时加入 平皿中
供试液中加入规定量的菌液
供试品对 照组
供试液直接加入平皿中
备注：编排上供试液制备2015年版移至计数方法适用性试验部分， 从结构上更合理。
计数方法适用性试验—供试液制备用稀释液
2010版
2015版
1.PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液 2.PH7.2磷酸盐缓冲液 3.PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用 于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸 盐缓冲液（用于结肠溶制剂）
培养基适用性检查—示例
名称
胰酪大豆胨液体培养基
阴性对照
取已灭菌胰酪大豆胨液体培养基，于30-35℃培养3天，观察其 是否变浑浊。
试验用菌株 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌
接种方法
分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌试验 用菌悬液于该培养基中，接种量不大于100cfu，摇匀。
细菌不超过3天；真菌、黑曲霉不超过5天。
固体培养基：0.5-2 液体培养基：生长良好。
培养基适用性检查—示例
名称
胰酪大豆胨琼脂培养基
阴性对照
取已灭菌胰酪大豆胨琼脂培养基15-20ml，注入直径90mm的无 菌平皿中，于30-35℃培养3天。